أخبار

شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
طورت الخلايا السرطانية آليات مختلفة للتغلب على الإجهاد الخلوي والاستمرار في التقدم.يعد البروتين كيناز R (PKR) ومنشط البروتين (PACT) المستجيبين الأوليين الذين يراقبون إشارات الإجهاد المختلفة التي تؤدي إلى تثبيط تكاثر الخلايا والاستماتة.ومع ذلك ، لا يزال تنظيم مسار PACT-PKR في الخلايا السرطانية غير معروف إلى حد كبير.هنا ، وجدنا أن الحمض النووي الريبي (RNA) الطويل غير المشفر (lncRNA) الأسبارتيل الحمض الريبي النووي النقال المضاد لتحسس الحمض النووي الريبي 1 (DARS-AS1) متورط بشكل مباشر في تثبيط مسار PACT-PKR ويعزز تكاثر الخلايا السرطانية.باستخدام الفحص الوظيفي على نطاق واسع لـ lncRNA المرتبط بالسرطان CRISPRi 971 ، وجدنا أن DARS-AS1 كان مرتبطًا بشكل كبير بتكاثر الخلايا السرطانية.لذلك ، يمنع خروج المغلوب DARS-AS1 تكاثر الخلايا ويعزز موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية في خطوط الخلايا السرطانية المختلفة في المختبر ويقلل بشكل كبير من نمو الورم في الجسم الحي.ميكانيكيًا ، يرتبط DARS-AS1 مباشرة بمجال تنشيط PACT ويمنع تفاعل PACT-PKR ، مما يقلل من تنشيط PKR ، وفسفرة eIF2α ، ويمنع موت الخلايا المبرمج.سريريًا ، يتم التعبير عن DARS-AS1 على نطاق واسع في العديد من السرطانات ، ويشير الإفراط في التعبير عن lncRNA هذا إلى سوء التشخيص.توضح هذه الدراسة التنظيم الخاص بالسرطان لمسار PACT-PKR بواسطة DARS-AS1 lncRNA وتوفر هدفًا آخر للتنبؤ بالسرطان وعلاجه.
تعد القدرة على التكيف مع الإجهاد سمة مهمة لبقاء الخلايا السرطانية وانتشارها.يصل الانتشار السريع والسمات الاستقلابية للسرطان إلى ذروتها في البيئات الدقيقة القاسية - الحرمان من المغذيات ونقص الأكسجة وانخفاض درجة الحموضة - التي يمكن أن تؤدي إلى مسارات إشارات موت الخلية.غالبًا ما يُلاحظ عدم انتظام الجينات الحساسة للإجهاد مثل p535 ، وبروتينات الصدمة الحرارية 6 ، و 7 ، و KRAS8 ، و 9 ، و HIF-110 ، و 11 ، و 12 ، و 13 في السرطان ، وبالتالي منع موت الخلايا المبرمج وتعزيز البقاء على قيد الحياة.
بروتين كيناز R (PKR) هو مستشعر إجهاد مهم ووحدة كيناز لعامل بدء حقيقيات النوى 2α (eIF2α) ، وهو منظم انتقالي يربط الإجهاد الخلوي بموت الخلية.تم تحديد PKR في الأصل على أنه بروتين مضاد للفيروسات عن طريق الكشف عن الحمض النووي الريبي الأجنبي مزدوج الشريطة (dsRNA).عند التنشيط ، فوسفوريلات PKR eIF2α لتثبيط تخليق البروتينات الفيروسية والخلوية.تم تحديد PACT (بروتين منشط PKR) كأول بروتين منشط PKR في غياب dsRNA.من خلال التفاعل المباشر مع PKR ، يقوم PACT بتحويل الضغوط المختلفة (تجويع المصل ، علاج البيروكسيد أو الزرنيخ) إلى PKR ومسارات الإشارات المصب.بالإضافة إلى الفسفرة eIF2α ، يؤدي تنشيط PKR بوساطة PACT إلى أحداث مختلفة مرتبطة باستجابة الإجهاد ، بما في ذلك حالة الأكسدة والاختزال المتغيرة عبر مسار PI3K / Akt24 ، والتحقق من تلف الحمض النووي المحسن عبر p5325 ، 26 و NF-κB27 ، 28 ينظم النسخ ، 29. نظرًا لدورها الحاسم في الاستجابة للإجهاد والانتشار والاستماتة والعمليات الخلوية الرئيسية الأخرى ، تعد PKR و PACT أهدافًا علاجية واعدة للعديد من الأمراض ، وخاصة السرطان.ومع ذلك ، على الرغم من هذه الأهمية الوظيفية والبيولوجية متعددة الاتجاهات ، فإن تنظيم نشاط PACT / PKR في الخلايا السرطانية لا يزال بعيد المنال.
lncRNAs هي نسخ أكبر من 200 نيوكليوتيد مع عدم وجود إمكانية لتشفير البروتين.منذ أن حددت أحدث مشاريع تسلسل الجينوم الكامل الآلاف من lncRNAs ، تم بذل 35،36 جهدًا كبيرًا لتوضيح وظائفها البيولوجية.أظهرت مجموعة متزايدة من الأبحاث أن lncRNAs تشارك في العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تنظيم تعطيل كروموسوم X ، وطبع 40 ، ونسخ 41 ، 42 ، والترجمة ، وحتى نمو السرطان 44 ، 45 ، 46 ، 47.ذكرت هذه الدراسات أن العديد من lncRNAs متورطة في مسار PACT / PKR.أظهرت إحدى هذه الدراسات أن lncRNA ASPACT يثبط نسخ PACT ويزيد من الاحتفاظ النووي بـ PACT mRNA.أظهرت دراسات أخرى أن lncRNA nc886 يرتبط بـ PKR ويمنع الفسفرة.حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن lncRNA الذي ينظم تنشيط PKR بوساطة PACT.
تم تحديد الحمض النووي الريبي 1 (DARS-AS1) المضاد لتركيبة Aspartyl-tRNA على أنه lncRNA المنشأ.من خلال تنظيم miP-194-5p53 و miP-12952 و miP-532-3p51 ، ثبت أن DARS-AS1 يعزز نمو سرطان الخلايا الكلوية الصافية وسرطان الغدة الدرقية وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة على التوالي.وجد تونغ وزملاؤه أيضًا أن DARS-AS1 يعزز تطور الورم النقوي من خلال الحفاظ على استقرار البروتين 39 (RBM39) الحافز المرتبط بالـ RNA.ومع ذلك ، لم يتم إجراء أي دراسات حول ما إذا كان lncRNA هذا متورطًا في تنظيم تنشيط PACT-PKR والاستجابة للتوتر للخلايا السرطانية.
هنا ، أجرينا شاشة فقدان الوظيفة على نطاق واسع باستخدام نظام CRISPRi وقررنا أن DARS-AS1 lncRNA يعزز تكاثر عدة أنواع من الخلايا السرطانية.بالإضافة إلى ذلك ، حددنا آلية رئيسية: يرتبط DARS-AS1 مباشرة بـ PACT ، ويمنع ربط PACT و PKR ، ويمنع فسفرة eIF2α ، وهي ركيزة PKR منخفضة ، وفي النهاية يمنع موت الخلايا المبرمج.في الختام ، يكشف عملنا عن DARS-AS1 lncRNA كمنظم لمسار PACT-PKR وهدف محتمل لعلاج السرطان والتنبؤ به.
حددت دراسات واسعة النطاق لتحديد السمات الجينومية المئات من lncRNAs المرتبطة بالسرطان.ومع ذلك ، تظل وظيفتهم غير معروفة إلى حد كبير.لتحديد مرشحي lncRNA الواعدين المشاركين في تطور السرطان ، أجرينا شاشة فقدان الوظيفة لتقليل الانتشار في خط خلايا سرطان القولون والمستقيم SW620 باستخدام نظام CRISPRi (الشكل 1 أ).الميزة الفريدة لخطوط خلايا سرطان القولون SW480 و SW620 هي أنها مشتقة من الأورام الأولية والثانوية في مريض واحد.يوفر هذا مقارنة قيمة لدراسة التغيرات الجينية في تطور سرطان القولون المتقدم.لذلك ، قمنا بتحليل نسخ خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم (SW480 و SW620) باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وجمعنا بعض lncRNAs الوظيفية المحتملة من الأدبيات المنشورة.بناءً على هذه النتائج ، قمنا بتصميم مكتبة مجمعة من sgRNA تحتوي على 7355 sgRNA oligos تستهدف 971 lncRNAs المرتبطة بالسرطان و 500 oligos sgRNA غير المستهدفة للتحكم السلبي (البيانات التكميلية 1).
التمثيل التخطيطي للفحص باستخدام نظام CRISPRi.ب تخصيب سجرنا بعد الفرز.يمثل الخط المنقط الأفقي log2 (تغيير الطية) = ± 0.58.يشير الخط المنقط العمودي إلى قيمة p = 0.05.تمثل النقاط السوداء sgRNA غير المستهدفة (المعينة باسم NC).النقاط الحمراء هي sgRNAs تستهدف DARS-AS1.النقاط الزرقاء عبارة عن sgRNAs تستهدف LINC00205 ، وهو lncRNA المسبب للورم الموصوف سابقًا.تغيير الطية = (القراءة العادية ، اليوم 17) / (القراءة العادية ، اليوم 0).أعاقت ضربة قاضية لـ DARS-AS1 sgRNA نمو الخلايا.تمثل أشرطة الخطأ ± الانحراف المعياري للتجارب الثلاث.* p ≤ 0.05 ، ** p ≤ 0.01 اختبار t للطالب ثنائي الذيل.تعبير DARS-AS1 في الأورام (مجموعة بيانات TCGA).em التعبير عن DARS-AS1 في عينات طبيعية وأورام مقترنة من المرضى الذين يعانون من BLCA و KIRC و PRAD و LUSC و UCEC و LUAD و LIHC و KIRP و COAD ، على التوالي (مجموعة بيانات TCGA).تم الحصول على قيم p باستخدام اختبار الطالب المزدوج الذيل.
بعد إنشاء البلازميد وتعبئة الفيروس البطيء ، قمنا بنقل خط خلية سرطان القولون والمستقيم dCas9-SW620 بالمكتبة أعلاه في أربع تجارب عدوى مستقلة.كان تعدد العدوى (MOI) لهذه العدوى من 0.1 إلى 0.3 ، مما يشير إلى أنه لا يمكن نقل العدوى إلا باستخدام سجرنا واحد.بعد 18 يومًا من الاستنبات في المختبر ، انخفض ملف التخصيب الخاص بـ sgRNAs المستهدفة أو زاد بعد الفحص ، بينما ظل عدد قليل النوكليوتيدات الضابطة غير المستهدفة دون تغيير نسبيًا مقارنة بملف تعريف الفرز المسبق ، مما يشير إلى أن هدفنا له شاشة محددة للغاية مكتبة.أرز.1 ب والجدول التكميلي 1). تم فحص LINC00205 ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا لتعزيز سرطان الرئة وتطور سرطان الكبد 58،59،60 ، (log2 (foldchange) <0.58 ، p value <0.05) ، مما يؤكد موثوقية هذا الفحص (الشكل 1 ب). تم فحص LINC00205 ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا لتعزيز سرطان الرئة وتطور سرطان الكبد 58،59،60 ، (log2 (foldchange) <0.58 ، p value <0.05) ، مما يؤكد موثوقية هذا الفحص (الشكل 1 ب). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1 ب). تم استبعاد LINC00205 ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا لتعزيز تطور سرطان الرئة وسرطان الكبد 58،59،60 ، (سجل 2 (تغيير أضعاف) <-0.58 ، قيمة p <0.05) ، مما يؤكد متانة هذا الفحص (الشكل 1 ب) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58،59،60 ， 被 筛选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1b）。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58،59،60 ， 被 筛选 掉 （log2 （倍数 变化） <-0.58 ， p 值 <0.05） ， 证实 了 该 筛选 的 可靠性 （图 1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1 ب). تم استبعاد LINC00205 ، الذي تم الإبلاغ عنه سابقًا لتعزيز تطور سرطان الرئة والكبد 58،59،60 ، (سجل 2 (تغيير أضعاف) <-0.58 ، قيمة p <0.05) ، مما يؤكد متانة هذا الفحص (الشكل 1 ب).
من بين جميع lncRNAs التي تم اختبارها ، تم فحص DARS-AS1 أيضًا ، مع انخفاض النوكليوتيدات الثلاثة المشابهة لـ sgRNA بشكل ملحوظ بعد 18 يومًا من الثقافة ، مما يشير إلى أن ضربة قاضية لهذا lncRNA أدت إلى تقليل انتشار السرطان (الشكل 1 ب).تم دعم هذه النتيجة بشكل أكبر من خلال تحليل MTS في خلايا سرطان القولون والمستقيم والذي أظهر أن معدل نمو خلايا ضربة قاضية DARS-AS1 انخفض إلى النصف فقط مقارنة بخلايا التحكم (الشكل 1 ج) وكان متسقًا مع التقارير السابقة للعديد من أنواع السرطان الأخرى.: سرطان الكلى ذو الخلايا الصافية ، وسرطان الغدة الدرقية وسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة 51،52،53،55.ومع ذلك ، تظل وظيفتها وآلياتها الجزيئية في سرطان القولون والمستقيم غير مكتشفة.لذلك ، اخترنا هذا lncRNA لمزيد من الدراسة.
لدراسة تعبير DARS-AS1 في المرضى ، قمنا بتحليل شامل لـ 10327 عينة ورم من مشروع أطلس جينوم السرطان (TCGA).تظهر نتائجنا أن DARS-AS1 يتم التعبير عنه على نطاق واسع ويتم تنظيمه بشكل كبير في الخلايا السليمة في مجموعة متنوعة من الأورام ، بما في ذلك سرطان القولون الغدي (COAD) ، وسرطان الخلايا الكلوية الصافية (KIRC) ، وسرطان الخلايا الحليمية الكلوية (KIRP)..عدد قليل جدًا (الشكل 1 د والشكل التكميلي 1 أ ، ب). أكد تحليل العينات الصحية / الورمية المقترنة أيضًا وجود تعبير أعلى بكثير من DARS-AS1 في أورام سرطان المثانة البولية (BLCA) ، وسرطان الخلايا الكلوية الصافية (KIRC) ، وسرطان البروستاتا الغدي (PRAD) ، وسرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC) وسرطان بطانة الرحم وجسم الرحم (UCEC) وسرطان الغدة الرئوية (LUAD) وسرطان الكبد (LIHC) وسرطان الخلايا الحليمية الكلوية (KIRP) وسرطان القولون الغدي (COAD) (قيمة p <0.05) (الشكل 1e – m) . أكد تحليل العينات الصحية / الورمية المقترنة أيضًا وجود تعبير أعلى بكثير من DARS-AS1 في أورام سرطان المثانة البولية (BLCA) ، وسرطان الخلايا الكلوية الصافية (KIRC) ، وسرطان البروستاتا الغدي (PRAD) ، وسرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC) وسرطان بطانة الرحم وجسم الرحم (UCEC) وسرطان الغدة الرئوية (LUAD) وسرطان الكبد (LIHC) وسرطان الخلايا الحليمية الكلوية (KIRP) وسرطان القولون الغدي (COAD) (قيمة p <0.05) (الشكل 1e – m) .أكد تحليل العينات الصحية / الورمية المقترنة أيضًا وجود تعبير أعلى بشكل ملحوظ عن DARS-AS1 في سرطان المثانة البولية (BLCA) ، وسرطان الخلايا الكلوية والكلوية الصافية (KIRC) ، وسرطان البروستاتا الغدي (PRAD) ، وسرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– م). ، وسرطان بطانة الرحم من الجسم الرحمي (UCEC) ، وسرطان الغدة الرئوية (LUAD) ، وسرطان الكبد (LIHC) ، وسرطان الخلايا الحليمية في الكلى (KIRP) ، وسرطان القولون الغدي (COAD) (قيمة p < 0.05) (الشكل 1e - م).配对 健康 / 肿瘤 样本 的 分析 进一步 证实 了 DARS-AS1 在 膀胱 尿路 上皮 癌 (BLCA) 、 肾 肾 透明 细胞 癌 (KIRC) 、 前列腺 腺癌 (PRAD) 、 肺 鳞状 细胞 癌 (LUSC) 肿瘤 中 的显 着 更高 表达 ， 子宫 体 子宫 内膜 癌 （UCEC） ， 肺 腺癌 （LUAD） ， 肝 LIHC） ， 肾 肾 乳头状 癌 （KIRP） 和 结肠 腺癌 （COAD） （p 值<0.05） （图 1e-m.配对 健康 / 肿瘤 样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮 癌 皮 癌 皮 癌 皮 癌 肾 肾 细胞 癌 细胞 癌 癌 细胞 癌 前列 腺 腺癌 腺癌 (برااد) (lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显 着 更 表达 ， 内膜 （（腺癌 （癌 乳头状癌 （kirp） （coad） （p 值 <0.05） （图 1e-m）.دعم تحليل العينات المقترنة بالصحة / الورم دور DARS-AS1 في سرطان المثانة البولية (BLCA) وسرطان الخلايا الكلوية الصافية (KIRC) وسرطان البروستاتا الغدي (PRAD) وسرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e م). التعبير في سرطان الجسم الرحمي (UCEC) ، وسرطان الغدة الرئوية (LUAD) ، وسرطان الخلايا الكبدية (LIHC) ، وسرطان الخلايا الحليمية الكلوية (KIRP) ، وسرطان القولون الغدي (COAD) (قيمة p <0.05) (الشكل 1e -m).مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن DARS-AS1 يتم التعبير عنه على نطاق واسع وبشكل كبير في مجموعة متنوعة من السرطانات.
نظرًا لأن DARS-AS1 و DARS (الجين الذي يشفر الخيط المضاد للحساسية) يشتركان في نفس المروج ويقعان بجوار بعضهما البعض ، فقد صممنا shRNA لضربة قاضية على وجه التحديد DARS-AS1 ولكن ليس DARS (الشكل التكميلي 2 أ ، ب والجدول التكميلي 2) .بالإضافة إلى SW620 ، استخدمنا أيضًا ثلاثة خطوط خلوية أخرى تعبر بشدة عن DARS-AS1 لدراسة فعالية ووظيفة ضربة قاضية shRNA (الجدول التكميلي 3).أشارت نتائجنا إلى أن جميع shRNAs الثلاثة التي تم تطويرها حققت كفاءة ضربة قاضية DARS-AS1 بنسبة 80 ٪ على الأقل مع تأثير ضئيل على كمية DARS mRNA (الشكل التكميلي 2c-f).بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن ضربة قاضية لـ DARS-AS1 باستخدام shRNAs هذه أعاقت نمو الخلايا بشكل كبير في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم SW620 (49.7٪) و HCT116 (27.7٪) ، خط خلايا سرطان الثدي MBA-MD-231 (53.4٪).) وخط خلايا الورم الكبدي HepG2 (اختزال بنسبة 92.7٪) ، فضلاً عن قدرتها على تكوين مجالات غير مترابطة (متوسط ​​التخفيض ~ 50.8٪ ، 44.6٪ ، 40.7٪ و 75.7٪ لكل خط خلية) (الشكل 2 أ ، ب).في SW620 ، أكدت نتائج فحص تكوين المستعمرة أيضًا أن DARS-AS1 shRNA منع بشكل كبير تكاثر الخلايا بمتوسط ​​انخفاض يبلغ حوالي 69.6٪ (الشكل 2 ج).
تأثير التحكم shRNA و DARS-AS1 shRNA على تكاثر الخلايا (أ) وتكوين كروي (ب) في خلايا SW620 و HCT116 و MBA-MD-231 و HepG2.ج تأثير التحكم shRNA و DARS-AS1 shRNA على تكوين المستعمرة في خلايا SW620.تكاثر الخلايا (د) ، وتشكيل كروي (هـ) ، وتشكيل مستعمرة (و) لخلايا SW620 التي تزيد من التعبير عن DARS-AS1.البيانات المعروضة هي يعني ± الانحراف المعياري لثلاث تجارب.* p ≤ 0.05 ، ** p 0.01 ، و *** p 0.001 بواسطة اختبار الطالب ثنائي الذيل.
لاستكمال دراسات فقدان الوظيفة ، أنشأنا بعد ذلك خلايا SW620 التي تزيد من التعبير عن DARS-AS1 (الشكل التكميلي 2g).زاد التعبير المفرط لـ DARS-AS1 بشكل كبير من نمو الخلايا (1.8 ضعفًا) ، وتكوين كروي غير مقيد (1.4 ضعف) ، وتكوين مستعمرة (3.3 أضعاف) في خلايا SW620 (الشكل 2 د-و).أكدنا هذه النتيجة باستخدام خط خلية آخر يعبر عن DARS-AS1 ، A549.تمت ملاحظة هذا التكاثر المحسن للخلايا بسبب الإفراط في التعبير عن DARS-AS1 في خلايا A549 (الشكل التكميلي 2 ح ، ط والجدول التكميلي 3).مجتمعة ، تُظهر دراسات المكسب والخسارة هذه أن DARS-AS1 يعزز تكاثر الخلايا السرطانية في المختبر.
لاستكشاف الآلية الأساسية التي ينظم بها DARS-AS1 تكاثر الخلايا ، أجرينا تحليلًا منسدلًا لـ RNA لتحديد شركائه المحتملين المرتبطين بالبروتين.أظهرت نتائج RT-qPCR أن حوالي 86.2٪ من DARS-AS1 يقع في سيتوبلازم خلايا SW620 (الشكل التكميلي 3 أ).تم تحضين DARS-AS1 أو الحمض النووي الريبي الكاذب المنسوخ في المختبر مع محللات خلية SW620 متبوعًا بفصل SDS-PAGE.أظهر تلطيخ الفضة اللاحق أن نطاقًا مميزًا (حوالي 38 كيلو دالتون) تم إثرائه بشكل كبير في عينات سحب DARS-AS1 ولكن ليس في عينات RNA الدمية أو عينات الخرز (الشكل 3 أ).تم تحديد هذا النطاق على أنه بروتين تنشيط PKR (PACT) عن طريق قياس الطيف الكتلي (MS) وتم تأكيده أيضًا عن طريق التكتل المناعي في خطوط الخلايا SW620 و HCT116 و HepG2 (الشكل 3 أ ، ب).تم أيضًا التحقيق في تخصيب DARS وبروتينات PACT ذات الصلة - PKR و TRBP - باستخدام تحليل RNA بواسطة النشاف الغربي (WB).أشارت النتائج إلى عدم وجود تفاعل مباشر بين DARS-AS1 RNA وهذه البروتينات الثلاثة (الشكل التكميلي 3 ب).تم تأكيد التفاعل المحدد بين DARS-AS1 و PACT بشكل أكبر من خلال تحليل RNA المناعي (RIP) ، والذي أظهر أن DARS-AS1 تم إثرائه بشكل كبير في الأجسام المضادة لـ PACT ولكن ليس RNAs الأخرى الضابطة (الشكل 3 ج).لتحديد ما إذا كان DARS-AS1 يتفاعل مباشرة مع PACT في غياب أي مكونات خلوية أخرى ، تم إجراء اختبار قياس التداخل في المختبر (BLI) باستخدام PACT المنقى.تم تجميد DARS-AS1 المسمى بالبيوتين أو الحمض النووي الريبي الوهمي على أجهزة الاستشعار الحيوية الستربتافيدين (SA) ثم حضنت في المخزن المؤقت الحركي الذي يحتوي على 1 ميكرومتر من PACT.والجدير بالذكر أن PACT مرتبط بشدة بـ DARS-AS1 (قيمة KD حوالي 26.9 نانومتر) ، ولكن ليس لتقليد الحمض النووي الريبي (الشكل ثلاثي الأبعاد).تُظهر هذه النتائج مجتمعة تفاعلًا مباشرًا وتقاربًا كبيرًا بين DARS-AS1 و PACT.
حدد تحليل سحب الحمض النووي الريبي DARS-AS1 يتفاعل مع PACT في خلايا SW620.أعلاه ، تلطيخ الفضة من البروتينات ذات الصلة.تم إجراء كتل مناعية سفلية باستخدام الأجسام المضادة لـ PACT.تم إجراء تحليل منسدل لـ RNA في خلايا HCT116 (أعلى) و HepG2 (أسفل).تم الكشف عن تخصيب PACT عن طريق التخصيب المناعي.تم إجراء فحوصات الترسيب المناعي (RIP) للـ cRNA في خلايا SW620 باستخدام الأجسام المضادة المشار إليها.تم الحصول على منحنيات ربط PACT إلى DARS-AS1 كامل الطول أو التحكم في الحمض النووي الريبي باستخدام قياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI).تم تجميد الحمض النووي الريبي على جهاز استشعار الستربتافيدين الحيوي.تم استخدام 1 ميكرومتر PACT لقياس الارتباط.تم إجراء اختبار سحب الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام DARS-AS1 كامل الطول المعالج حيوياً أو مبتوراً (أعلى).لطخة مناعية تظهر PACT المستلمة (أسفل).f تم تحضين PACT المنقى الذي تم وضع علامة عليه باستخدام DARS-AS1 كامل الطول المعالج حيوياً أو مبتوراً (كما في هـ) لمقايسة RIP في المختبر.تم التحقق من الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة RT-qPCR.تم الحصول على التقارب النسبي لشظايا RNA المختلفة لـ PACT باستخدام قياس التداخل biolayer.للتحليل ، تم استخدام 100 نانومتر RNA و 1 ميكرومتر RAST.تم إجراء فحوصات RIP في المختبر باستخدام PACT المنقى أو المقطوع المسمى PACT.تم التحقق من الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة RT-qPCR.i معدل نمو خلايا SW620 المفرط في التعبير عن DARS-AS1 أو PACT أو كليهما.كان للإفراط في التعبير عن DARS-AS1 كامل الطول أو المقطوع في خلايا SW620 تأثيرات مختلفة على نمو الخلايا.تم الكشف عن موت الخلايا المبرمج k عن طريق التجلط المناعي مع الأجسام المضادة لـ PARP.l الضربة القاضية لـ DARS-AS1 يحث على موت الخلايا المبرمج لخلايا SW620 كما هو موضح في قياس التدفق الخلوي.البيانات المعروضة هي يعني ± الانحراف المعياري لثلاث تجارب. * p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، *** p ≤ 0.001، **** p <0.0001، عن طريق اختبار t للطالب ثنائي الذيل. * p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، *** p ≤ 0.001، **** p <0.0001، عن طريق اختبار t للطالب ثنائي الذيل. * p ≤ 0،05، ** p ≤ 0،01، *** p ≤ 0،001، **** p <0،0001 по двустороннему критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، *** p ≤ 0.001، **** p <0.0001 بواسطة اختبار الطالب ثنائي الذيل. * ص ≤ 0.05 ، ** ص ≤ 0.01 ، *** ص ≤ 0.001 ، **** ف <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 ر 检验。 * ص ≤ 0.05 ، ** ص ≤ 0.01 ، *** ص ≤ 0.001 ، **** ف <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 ر 检验。 * p ≤ 0،05، ** p ≤ 0،01، *** p ≤ 0،001، **** p <0،0001 по двустороннему критерию Стьюдента. * p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، *** p ≤ 0.001، **** p <0.0001 بواسطة اختبار الطالب ثنائي الذيل.
قمنا بعد ذلك بإنشاء ثلاثة أجزاء من الحمض النووي الريبي DARS-AS1 المعالجة حيوياً عن طريق النسخ في المختبر لتحديد منطقة DARS-AS1 المطلوبة لرابطة PACT (الشكل 3 هـ).أظهرت نتائج تحليل الحمض النووي الريبي أن كل جزء كان قادرًا على التفاعل مع PACT ، لكن المنطقة الطرفية 3′ (384-768 نيوكليوتيدات المسمى A3) أظهرت أكثر من 1–384 نيوكليوتيدات المسمى A1) (الشكل 3 هـ).ولوحظت نتائج مماثلة في اختبار RIP في المختبر باستخدام PACT المؤتلف (الشكل 3f).تمشيا مع هذه النتائج ، أظهرت التجارب لربط شظايا الحمض النووي الريبي المعطلة بـ PACT باستخدام BLI أيضًا أن PACT لها تقارب أعلى لـ A3 (384-768 نانومتر) (قيمة KD تبلغ 94.6 نانومتر تقريبًا) ، بينما لا توجد روابط تقريبًا مع مناطق أخرى.(الشكل ثلاثي الأبعاد).
قمنا أيضًا بفحص مناطق الربط المرتبطة في PACT.يحتوي PACT على ثلاثة مجالات وظيفية ، اثنان منها محفوظان في مجالات ربط RNA مزدوجة الشريطة (dsRBD) ومجال ثالث (المعين D3) يعمل كمنشط لتفاعلات البروتين.لفحص قدرة ربط lncRNA لكل مجال ، قمنا بتصميم ثلاث طفرات تزيل كل مجال من المجالات الثلاثة وأجرينا اختبار RIP في المختبر.أظهرت نتائجنا أن حذف المجال الثالث (D3) من PACT قلل بشكل كبير من تفاعله مع DARS-AS1 (بمقدار 0.11 ضعفًا مقارنةً بـ PACT السليم) مقارنةً بالطفرتين الأخريين (الشكل 3 ح) ، فقد تبين أن الإصدار من D3 تفاعل مع DARS.-AC1.مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن التفاعل بين DARS-AS1 و PACT قد يحدث بشكل أساسي من خلال 3 نهاية DARS-AS1 ومجال D3 من PACT.
لاحظنا أن DARS-AS1 لم يكن له أي تأثير على تعبير PACT ولم يكن لـ PACT أي تأثير على DARS-AS1 (الشكل التكميلي 3 ج).ثم قمنا بفحص تأثير ضربة قاضية PACT على نمو الخلايا.على عكس DARS-AS1 ، نمت الخلايا النسبية بمعدل 1.5 إلى 3 مرات أسرع عندما تم تدمير PACT (الشكل التكميلي 3 D).أشارت نتائج فحص تكوين المستعمرة إلى أن الخلايا شكلت مستعمرات 2-3 أضعاف بعد علاج shRNA باستخدام PACT (الشكل التكميلي 3 هـ).لاختبار ما إذا كان DARS-AS1 ينظم تكاثر الخلايا من خلال PACT ، أنشأنا خلايا SW620 التي تعبر عن PACT أو DARS-AS1 أو كليهما.أظهر الإفراط في التعبير عن PACT تثبيطًا كبيرًا لتكاثر الخلايا (الشكل 3 ط).في حين أن الإفراط في التعبير عن DARS-AS1 في حد ذاته عزز بشكل كبير تكاثر الخلايا ، لم يكن هناك فرق كبير في معدل نمو الخلايا المفرطة في التعبير عن DARS-AS1 و PACT.تشير هذه النتائج إلى أن PACT قد تتعارض مع الانتشار المتزايد الناجم عن فرط التعبير DARS-AS1.
نظرًا لأن مناطق مختلفة من DARS-AS1 لها قدرات ربط PACT مختلفة ، فقد بحثنا في تأثيرها النسبي على تكاثر الخلايا من خلال التعبير المفرط المختلف لشظايا DARS-AS1.بالمقارنة مع الشظيتين الأخريين ، تم التعبير عن DARS-AS1 بشكل مفرط عند الطرف 3 (384-768 nt) ، المنطقة الرئيسية المرتبطة بـ PACT في DARS-AS1 ، والتي تتمتع بأعلى قدرة على تحفيز تكاثر الخلايا (الشكل 3 ي).تشير هذه النتائج إلى وجود علاقة إيجابية بين قدرة الربط والوظيفة البيولوجية لـ DARS-AS1.
تم الإبلاغ عن PACT ليكون بروتينًا مؤيدًا للاستماتة.لذلك ، قمنا بالتحقيق في تأثير DARS-AS1 على موت الخلايا المبرمج.كما هو متوقع ، زادت ضربة قاضية DARS-AS1 بشكل كبير من انقسام PARP في خلايا SW620 وزادت نسبة الخلايا الموجبة V الملحقة في خطوط الخلايا SW620 و HCT116 و HepG2 و MBA-MD-231 (الشكل 3 ك).3).3f-h) ، مما يشير إلى أن التأثير المضاد لموت الخلايا المبرمج لـ DARS-AS1 في الخلايا السرطانية هو عكس وظيفة PACT التي تحفز موت الخلايا المبرمج.مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن آلية وظيفة الورم DARS-AS1 قد تكون من خلال تثبيط وظيفة PACT.
بعد ذلك ، استكشفنا الآثار الوظيفية لرابطة DARS-AS1-PACT.تم الإبلاغ عن PACT لتنشيط PKR من خلال التفاعل المباشر ، مما يعزز لاحقًا فسفرة eIF2α ، مما يتسبب في الحذف الترجمي وموت الخلايا المبرمج.أولاً ، درسنا ما إذا كان DARS-AS1 يؤثر على التوطين الخلوي لـ PACT و PKR.أظهر الفحص المجهري مضان متحد البؤر أن PACT و PKR متلازمتان للغاية في خلايا SW620 بمتوسط ​​معامل ارتباط Pearson يبلغ 0.72.وفي الوقت نفسه ، أدى التعبير الزائد DARS-AS1 إلى انخفاض كبير في التوطين المشترك لـ PACT و PKR (يعني معامل ارتباط بيرسون 0.61) (الشكل 4 أ).لاستكشاف ما إذا كان DARS-AS1 يمكن أن يعدل تفاعل PACT-PKR ، أجرينا اختبارًا مناعيًا مشتركًا (co-IP) مع الأجسام المضادة لـ PACT في محللات الخلية SW620.تم إثراء PKR بشكل كبير في مضادات PACT في خلايا التحكم ، بينما تم تقليل استرداد PKR بشكل كبير في lysates من الخلايا المفرطة في التعبير عن DARS-AS1 (الشكل 4 ب).تم استخدام PACT و PKR المنقى المسمى PACT لفحوصات ربط البروتين في المختبر.وفقًا لذلك ، أظهرت تلك التي قدمت DARS-AS1 ولكن لم يتم التحكم في RNA تفاعل PACT-PKR المكبوت (الشكل 4 ج).أظهرت جميع النتائج أن DARS-AS1 عطل اتصال PACT و PKR.
لوحظ توطين مشترك لـ PACT و PKR في خلايا التحكم أو الخلايا المفرطة في التعبير عن DARS-AS1 باستخدام مجهر مضان متحد البؤر.كانت النوى ملطخة بـ DAPI.تم الحصول على النتائج الإحصائية من 16 صورة فوتوغرافية.(ب) الترسيب المناعي المشترك (co-IP) باستخدام الجسم المضاد المضاد لـ PACT في الخلايا الخلوية للتحكم في خلايا SW620 أو الخلايا التي تزيد من التعبير عن DARS-AS1.ج تم تحضين PACT المسمى ، PKR المنقى ونسخه في المختبر باستخدام DARS-AS1 أو RNA الوهمي لتحليل ربط البروتين في المختبر.تم استخدام الأجسام المضادة للعلم من أجل الترسيب المناعي.(د) تم إجراء كتل مناعية مع الأجسام المضادة المشار إليها في خلايا SW620 و HCT116 المنقولة باستخدام shRNA للتحكم أو DARS-AS1-shRNA متبوعًا بتجويع المصل.غيرت مستويات التعبير DARS-AS1 الحساسية الخلوية للثابسيغارجين.تم نقل خلايا SW620 باستخدام DARS-AS1 shRNA أو DARS-AS1 أو بلازميد التحكم.عولجت الخلايا بالثابسيجارجين لمدة 48 ساعة وتم تحديد صلاحية الخلية باستخدام كاشف MTS.f في المختبر تم نسخ DARS-AS1 أو الحمض النووي الريبي الوهمي و PACT المنقى لفحص التنشيط في المختبر واكتشاف اللطخة المناعية.تم إجراء ططخات مناعية باستخدام هذه الأجسام المضادة على خلايا SW620-ctrl (يسار) أو الخلايا التي تفرط في التعبير عن طفرات PKR (يمين).ثم تم نقل هذه الخلايا باستخدام shRNA للتحكم أو DARS-AS1-shRNA متبوعًا بتجويع المصل.أظهر قياس التدفق الخلوي أن تعطيل PKR الطافر يعوض موت الخلايا المبرمج الذي يسببه DARS-AS1 في خلايا SW620.تم إجراء طقطقات مناعية مع الأجسام المضادة المشار إليها في خلايا SW620 (يسار) أو HCT116 (يمين).الخلايا المنقولة عن طريق التحكم shRNA أو DARS-AS1 shRNA محرومة من المصل وتستكمل بمثبط 100 نانومتر PKR C16 أو DMSO.شريط المقياس = 5 ميكرومتر.البيانات المعروضة هي يعني ± الانحراف المعياري لثلاث تجارب.* p ≤ 0.05 اختبار الطالب ثنائي الذيل.
من المعتقد عمومًا أنه بمجرد تفاعل PACT مع PKR17 ، يمكن إحداث فسفرة PKR عند Thr451.أشارت نتائجنا إلى أن مستوى الفسفرة PKR قد ارتفع بشكل ملحوظ في خلايا ضربة قاضية DARS-AS1 بعد تجويع المصل (الشكل 4 د والشكل التكميلي 4 أ).وفقًا لذلك ، وجدنا أن فسفرة eIF2α ، الركيزة الرئيسية PKR ، قد زادت أيضًا بشكل كبير بواسطة DARS-AS1 shRNA (الشكل 4 د والشكل التكميلي 4 أ).Thapsigargin هو عامل إجهاد ER يؤدي إلى إطلاق ER Ca2 +.تم الإبلاغ عن العلاج باستخدام thapsigargin للحث على التعبير عن PACT وتنشيطه ، والذي يتفاعل بشكل أكبر مع PKR وينشطه ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج عن طريق زيادة فسفرة eIF2α 18،61.هنا ، استخدمنا thapsigargin كمحفز لمسار PACT / PKR لاستكشاف ما إذا كان DARS-AS1 يمكن أن يساعد الخلايا في التغلب على الإجهاد عن طريق تثبيط مسار PACT / PKR.لاحظنا أن مستوى تعبير DARS-AS1 يرتبط ارتباطًا إيجابيًا بمقاومة الخلية لـ thapsigargin.نجت خلايا SW620 التي تفرط في التعبير عن DARS-AS1 بشكل أفضل عند معالجتها بالثابسيغارجين ، بينما أصبحت الخلايا ذات الضربة القاضية DARS-AS1 أكثر عرضة (الشكل 4 هـ).تمشيا مع هذه النتائج ، أدى الإفراط في التعبير DARS-AS1 إلى تقليل الفسفرة المستحثة بالثابسيجارجين PKR (الشكل التكميلي 4 ب).في المقابل ، بعد علاج thapsigargin ، تم فسفرة PKR و eIF2α إلى حد أعلى في خلايا ضربة قاضية DARS-AS1 مقارنة بخلايا التحكم (الشكل التكميلي 4 ب).ومن المثير للاهتمام ، أن ثابسيجارجين تسبب في تعبير DARS-AS1 بطريقة تعتمد على الجرعة ، مما قد يشير إلى وظيفة مقاومة الإجهاد لـ DARS-AS1 (الشكل التكميلي 4 ج).بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا فحوصات التنشيط في المختبر لتأكيد هذه الملاحظات.باختصار ، تمت تنقية PKR من محللات الخلية باستخدام جسم مضاد لـ PKR ، ثم تم تحضينه باستخدام PACT المؤتلف و DARS-AS1 الذي تم نسخه في المختبر.بعد التفاعل الأنزيمي ، تم الكشف عن phospho-PKR باستخدام WB.أشارت نتائجنا إلى أن الفسفرة PKR تم تثبيطها بشكل كبير بواسطة DARS-AS1 ، ولكن ليس عن طريق التحكم RNA (الشكل 4f).تشير هذه النتائج في المختبر وفي الجسم الحي إلى أن DARS-AS1 يثبط تنشيط PKR بوساطة PACT.في الوقت نفسه ، لاحظنا أيضًا انخفاضًا في استرداد PACT في وجود DARS-AS1 (الشكل 4f).تتوافق هذه النتيجة مع نتائج اختبار ربط البروتين في المختبر (الشكل 4 ج) وتوضح مرة أخرى وظيفة الحجب لـ DARS-AS1 لرابطة PACT-PKR.
مطلوب Ser246 و Ser287 في مجال D3 من PACT لتنشيط PKR تحت الضغط الخلوي.أعطى استبدال اثنين من بقايا السيرين للألانين PACT (mutD) المتحولة ، والتي قامت بتنشيط PKR في غياب الإجهاد ، واستبدال الألانين (mutA) عكس البروتوكول.نظرًا لأننا أظهرنا أهمية هذا المجال بالارتباط المباشر مع DARS-AS1 ، فقد أنشأنا هذين الطفرات PACT لاختبار ما إذا كان يمكن أيضًا مشاركة هذه البقايا في التفاعل مع DARS-AS1.ومن المثير للاهتمام أن كلا الطافرين فقدا القدرة على الارتباط بـ DARS-AS1 (الشكل التكميلي 4 د) ، مما يشير إلى أن البنية الكاملة لبروتين PACT قد تكون مطلوبة للتفاعل الفعال مع DARS-AS1.
علاوة على ذلك ، تشير نتائجنا أيضًا إلى أنه يمكن استعادة تثبيط تكاثر الخلايا الناجم عن DARS-AS1-shRNA جزئيًا عن طريق الإفراط في التعبير عن متحولة PACT سلبية سائدة (PACTmutA) أو متحولة PKR سلبية سائدة (PKRmut) (الشكل التكميلي 4 هـ. هـ).أدى الإفراط في التعبير عن طفرات PKR السلبية المهيمنة إلى تقليل فسفرة PKR الناجم عن ضربة قاضية لـ DARS-AS1 وكذلك فسفرة eIF2α في الخلايا المحرومة من المصل (الشكل 4g).والأهم من ذلك ، أن نسبة الخلايا المبرمج الناجم عن ضربة قاضية DARS-AS1 قد انخفضت أيضًا في الخلايا التي تفرط في التعبير عن PKRmut (الشكل 4 ح والشكل التكميلي 4g).يؤدي تثبيط نشاط PKR كيناز أيضًا إلى إعاقة وظيفة DARS-AS1 ، حيث أظهرت النتائج أن ضربة قاضية DARS-AS1 نادرًا ما تسبب في تفسفر PKR و eIF2α عندما عولجت الخلايا بمثبط C16 خاص بـ PKR (الشكل 4i والشكل التكميلي 4 ح).).مجتمعة ، تشير نتائجنا إلى أن DARS-AS1 يعزز تكاثر الخلايا ، على الأقل جزئيًا ، عن طريق تثبيط تنشيط PKR بوساطة PACT.
لمزيد من استكشاف دور DARS-AS1 في تكوين الأورام ، أجرينا تجارب في الجسم الحي باستخدام نموذج طعم أجنبي للماوس. تظهر النتائج أن ضربة قاضية لـ DARS-AS1 أدت إلى انخفاض نمو الورم بشكل كبير في الفئران (قيمة p <0.0001) (الشكل 5 أ). تظهر النتائج أن ضربة قاضية لـ DARS-AS1 أدت إلى انخفاض نمو الورم بشكل كبير في الفئران (قيمة p <0.0001) (الشكل 5 أ). Результаты показывают، то нокдаун DARS-AS1 резко опухоли у мышей (значение p <0،0001) (рс. تظهر النتائج أن ضربة قاضية DARS-AS1 تقلل بشكل كبير من نمو الورم في الفئران (قيمة p <0.0001) (الشكل 5 أ).结果 表明 ， DARS-AS1 的 敲 低 显 着 降低 了 小鼠 的 肿瘤 生长 （p 值 <0.0001） （图 5a）。结果 表明 ， DARS-AS1 的 敲 低 显 着 降低 了 小鼠 的 肿瘤 生长 （p 值 <0.0001） （图 5a）。 Результаты показали، то нокдаун DARS-AS1 значительно опухоли у мышей (значение р <0،000с1.) (5). أظهرت النتائج أن ضربة قاضية DARS-AS1 قللت بشكل كبير من نمو الورم في الفئران (قيمة p <0.0001) (الشكل 5 أ).وهكذا ، في مجموعة الضربة القاضية DARS-AS1 ، كان هناك انخفاض كبير في متوسط ​​حجم الورم بحوالي 72.9 ٪ ومتوسط ​​كتلة الورم بنحو 87.8 ٪ (الشكل 5 ب-د).تشير هذه النتائج بقوة إلى أن DARS-AS1 يمكن أن يعزز نمو الورم بشكل كبير في الجسم الحي.
آثار ضربة قاضية للإعلان DARS-AS1 على تكوين الأورام القولون والمستقيم في الفئران العارية.تظهر منحنيات النمو (أ) ، وحجم الورم (ب) ، والوزن (ج) ، وصور الورم (د).تمثل أشرطة الخطأ ± SEM. n = 10. **** p <0.0001 ، بواسطة اختبار t للطالب ثنائي الذيل. n = 10. **** p <0.0001 ، بواسطة اختبار t للطالب ثنائي الذيل. ن = 10. **** ف <0،0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. **** p <0.0001 اختبار الطالب ثنائي الذيل.ن = 10. **** ف <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 **** ف <0.0001 ， 通过 双 尾 学生 t 检验。 **** p <0،0001 по двустороннему критерию Стьюдента. **** p <0.0001 اختبار الطالب ثنائي الذيل.حلل e Kaplan-Meier العلاقة بين مستويات تعبير DARS-AS1 والبقاء الكلي للمرضى الذين يعانون من UVM و KICH و KIRP و MESO و GBM و LGG.كانت المستويات العالية من تعبير DARS-AS1 في المرضى في أعلى 50٪ ؛كان المستوى المنخفض من تعبير DARS-AS1 في المرضى في أدنى 50 ٪.تم تحديد قيم p باستخدام اختبار رتبة السجل.f النموذج المقترح الذي ينظم فيه DARS-AS1 مسار PACT-PKR ونمو الورم.
لفهم التأثير السريري لـ DARS-AS1 بشكل أفضل ، قمنا بفحص العلاقة بين تعبيره وبقاء المريض.من خلال تحليل مجموعة بيانات TCGA ، وجدنا أن تعبير DARS-AS1 العالي كان مرتبطًا بسرطان الجلد العنبي (UVM) ، ورهاب الكروموفوبيا الكلوي (KICH) ، وسرطان الخلايا الحليمية الكلوية (KIRP) ، وورم الظهارة المتوسطة (MESO) ، وتعدد الإرسال.ارتبط انخفاض البقاء على قيد الحياة بشكل كبير بتشكيل الورم الأرومي الدبقي (GBM) والمرضى الذين يعانون من ورم دبقي في الدماغ منخفض الدرجة (LGG) (الشكل 5 هـ).تشير هذه النتائج إلى أن DARS-AS1 قد يلعب دورًا مهمًا في تقدم الورم السريري وقد يكون علامة حيوية تنبؤية محتملة في العديد من السرطانات.
في هذه الدراسة ، باستخدام الفحص الوظيفي CRISPRi واسع النطاق ، قررنا أن DARS-AS1 lncRNA يتغلب على إجهاد الخلايا السرطانية من خلال تنظيم اثنين من المستجيبين الرئيسيين للضغط ، PACT و PKR.من خلال التفاعل المباشر مع PACT ، قام DARS-AS1 بتثبيط تنشيط PKR بوساطة PACT ، وبالتالي منع موت الخلايا المبرمج وتعزيز تكاثر الخلايا (الشكل 5f).تمت ملاحظة زيادة تنظيم DARS-AS1 في أنواع متعددة من السرطان ، مما يشير إلى أن وظيفته في تعزيز بقاء الخلايا السرطانية في ظل ظروف مرهقة قد تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنواع متعددة من السرطان.
تم تحديد PACT كبروتين منشط PKR ، ويلعب تنشيط PKR بوساطة PACT دورًا مهمًا في استجابات الإجهاد من خلال تنظيم النسخ والترجمة والاستماتة والعمليات الخلوية المهمة الأخرى.على مدى عقود ، بذلت محاولات لفهم التنظيم الخاص بالسرطان في سلسلة PACT-PKR.هنا ، كشفت دراستنا عن آلية مختلفة لتنظيم PACT-PKR في الخلايا السرطانية من خلال lncRNA DARS-AS1 الخلوي ، والذي يرتبط مباشرة بـ PACT ، ويمنع تفاعل PACT-PKR ، ويمنع تنشيط PKR و eIF2α فسفرة ، وبالتالي يمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن الإجهاد و تحفيز انتشار السرطان في نهاية المطاف.الخلايا.يلقي هذا الاكتشاف الضوء على الأهداف المحتملة للـ lncRNA في تشخيص السرطان وعلاجه.
أظهرت بياناتنا أن ضربة قاضية DARS-AS1 تحسس الخلايا لتجويع المصل مع زيادة كبيرة في PKR و eIF2α الفسفرة.تشير هذه النتائج إلى أن DARS-AS1 يعزز بقاء الخلايا السرطانية في ظل ظروف قاسية عن طريق تثبيط نشاط PACT / PKR.العديد من RNAs الأخرى غير المشفرة ، مثل ASPACT و nc886 ، تشارك أيضًا في محور PACT / PKR عن طريق تقليل تنظيم PACT48 mRNA أو تنظيم الفسفرة الذاتية عن طريق الارتباط بـ PKR 49،50،64.من بينها ، يعمل DARS-AS1 كمعطل لاتحاد PACT-PKR.تثري هذه الدراسة فهمنا لتنظيم محور PACT / PKR ودور lncRNAs في استجابات الإجهاد.
يحتوي PACT على ثلاثة مجالات منفصلة.كل من أول اثنين من dsRBDs كافٍ لتحقيق ارتباط تقارب عالي لـ PACT بـ PKR ، في حين أن المجال الثالث (D3) مطلوب لتنشيط PKR في المختبر وفي الجسم الحي.أظهرت دراستنا أن DARS-AS1 يتفاعل بشكل تفضيلي مع مجال D3 (الشكل 3 ح).بالنظر إلى الحجم الكبير للـ lncRNA (768 نيوكليوتيدات) ، فإن ارتباط DARS-AS1 بـ D3 يمكن أن يثبط فعليًا التفاعل بين مجال PACT لـ dsRBD و PKR ، وبالتالي يمنع ارتباط PACT و PKR.أدت طفرات نقطة PACT التي حلت محل Ser246 و Ser287 في D3 مع الألانين أو الأسبارتات إلى تعطيل تقاربها الملزم لـ DARS-AS1 ، مما يشير إلى أهمية الخصائص الهيكلية والكهربائية الشاملة لـ D3 في ارتباطها.ستكون هناك حاجة إلى مزيد من التفاصيل حول هذه الآلية في المستقبل ، باستخدام تحليل كيميائي حيوي أكثر دقة وتحليل هيكلي PACT عالي الدقة.
أفادت الدراسات السابقة أن DARS-AS1 يعزز تكاثر الخلايا من خلال عدة آليات.في أحد الأمثلة ، لاحظ الباحثون أن DARS-AS1 أعاد تنظيم جين DARS المشفر للبروتين المضاد للدلالة من خلال استهداف miP-194-5p في خلايا سرطان الكلى.ومع ذلك ، في هذه الدراسة ، كان لضربة قاضية DARS-AS1 تأثير ضئيل على نسخ DARS في أنواع متعددة من السرطان ، بما في ذلك على الأقل سرطان القولون والمستقيم والثدي والكبد.نظرًا لأن lncRNAs تُظهر أنماط تعبير خاصة بالخلايا والأنسجة ، فقد لا يتم حفظ الآليات الوظيفية عبر أنواع السرطان ، مما قد يساهم في هذا التناقض بين ملاحظاتنا والتقييمات السابقة لأنواع السرطان المختلفة.هناك حاجة لدراسات خاصة لتوضيح الآليات المحددة لمختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية.
أظهر تحليل البيانات السريرية أن تعبير DARS-AS1 في الأورام يرتبط عكسياً ببقاء مرضى السرطان على قيد الحياة ، مما يؤكد أهمية محور DARS-AS1 / PACT / PKR في تشخيص السرطان.في الختام ، تُظهر دراستنا أن DARS-AS1 هو منظم لمحور إشارات PACT / PKR ، ويعزز تكاثر الخلايا السرطانية ، ويمنع موت الخلايا المبرمج أثناء الاستجابة للضغط ، مما يوفر خطًا آخر من البحث ويهتم بالأبحاث المستقبلية في العلاجات المحتملة .
تم الحصول على خطوط الخلايا البشرية SW620 و A549 و MBA-MD-231 و HCT116 و HepG2 و HEK293T من البنية التحتية لموارد خط الخلايا الوطنية في الصين.تم الحفاظ على جميع الخلايا في وسط DMEM (DMEM ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA) مكملًا بنسبة 10 ٪ FBS (الجوزاء ، بروكلين ، نيويورك) و 1 ٪ بنسلين ستربتومايسين (Thermo Fisher Scientific) عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون.حاضنة.
مكافحة PACT ، Abcam (ab31967) ؛مكافحة PKR ، Abcam (ab184257) ؛Anti-PKR (phospho-T451) ، Abcam (ab81303) ؛مكافحة العلم ، Abcam (ab125243) ؛Anti-eIF2α ، Abcam (A0764)) ؛مضاد لـ eIF2α (الفوسفور S51) ، Abcam (ab32157) ؛مضاد PACT (الفوسفور S246) ، Abgent (AP7744b) ؛مضاد β-tubulin ، CST (2128) ؛الماوس العادي IgG ، CST (5415S) ؛الأرنب العادي IgG، CST (2729S).تم تخفيف الأجسام المضادة بنسبة 1: 1000 في PBST من أجل النشاف الغربي و 1: 100 لـ IP.
تم تطوير sgRNAs باستخدام أداة متاحة للجمهور تسمى CRISPR-ERA66.استخدمنا معلمات الأداة الافتراضية لتطوير sgRNA ومواقع ربط sgRNA المحسوبة بالخوارزمية في منطقة 3 كيلو بايت.تتمحور في TSS.تم تصنيع تجمعات من oligonucleotides sgRNA في CustomArray، Inc. (Bothewell ، WA) وتم استنساخها في بلازميدات pgRNA المتوافقة مع البشر (Addgene # 44248).تم نقل ما مجموعه 12 ميكروغرام من بلازميد pgRNA المتوافق مع البشر ، و 7.2 ميكروغرام من psPAX2 (Addgene # 12260) ، و 4.8 ميكروغرام من pMD2.G (Addgene # 12259) إلى 5 × 106 HEK293T في أطباق 10 سم باستخدام كاشف تحلل DNA. خلايا (CWBIO ، بكين ، الصين) باتباع إرشادات الشركة المصنعة.تم جمع المواد الطافية المحتوية على فيروسات بعد 48 و 72 ساعة من ترنسفكأيشن وتم ترشيحها من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.للفحص ، تم الحصول على خلايا SW620 التي تعبر عن بروتين الاندماج dCas9 / KRAB عن طريق نقل الفيروس.تم إصابة خلايا SW620 المعدلة بمكتبة الفيروسات في أربع تجارب عدوى مستقلة في وزارة الداخلية من 0.1-0.3 وتم أخذ عينات من 2 ميكروغرام / مل من بوروميسين (سيجما ، سانت لويس ، MO) لمدة يومين.بعد ذلك ، تمت زراعة الخلايا لمدة 18 يومًا في المختبر مع تغطية مكتبة بحد أدنى 500 خلية / سجرنا للفحص.
تم استخراج الحمض النووي الجيني وفقًا لتعليمات QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN ، Düsseldorf ، Germany ؛ 51183).في المجموع ، تم استخدام 100 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني لكل تكرار بيولوجي لبناء المكتبة.تم تضخيم منطقة sgRNA بجولتين من PCR وربطها برمز شريطي.
تمت تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية NucleoSpin® gel و PCR (MACHEREY-NAGEL ، Düren ، ألمانيا ؛ 740609.250) وقياسها باستخدام مجموعة Qubit ™ HS للكشف عن الحمض النووي المزدوج (Thermo Fisher Scientific ؛ Q32854).
تم استخدام اختبار MTS لقياس تكاثر الخلايا.تم زرع الخلايا في 96 طبقًا جيدًا بكثافة أولية 2000 خلية / بئر.تم قياس العدد النسبي للخلايا يوميًا في الوقت المحدد لمدة 4-6 أيام.لكل بئر ، تم تخفيف 20 ميكرولتر من كاشف MTS (Promega) باستخدام 100 ميكرولتر من DMEM ، واحتضانها بالخلايا لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، ثم تم قياس OD490.
تم اكتشاف القدرة على النمو غير المترابط من خلال تحليل تكوين المجالات.باختصار ، تم زراعة 2000 خلية منقولة باستخدام shRNA DARS-AS1 أو التحكم في shRNA في صفيحات صغيرة شديدة الارتباط (Corning) مع تغيير متوسط ​​كل 4 أيام.تم عد الأجسام الشبه الكروية بعد 14 يومًا.تم استخدام 500 خلية منقولة باستخدام بلازميد DARS-AS1 أو بلازميد تحكم لمقايسة التحسين ، وإلا فإن الطريقة لم تتغير.
تم نسخ RNA باستخدام T7 RNA polymerase و biotin-16-UTP (Roche 1138908910) وفقًا لتعليمات Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).يتم سرد الاشعال المستخدمة هنا في الجدول التكميلي 4.
تم استنساخ مناطق PACT أو PKR المشفرة للبروتين في pET15b (Addgene # 73619) وتحويلها إلى BL21 (DE3).تم تحضين البكتيريا طوال الليل في LB المزود بالأمبيسيلين ثم تم تخفيفه 100 مرة باستخدام LB جديد.عندما وصل OD للوسط إلى 0.8 ، تمت إضافة 1 ملي مولار IPTG للحث على التعبير عن البروتين.بعد الحضانة طوال الليل مع اهتزاز لطيف (250 دورة في الدقيقة عند 20 درجة مئوية) ، تم جمع حبيبات الخلية بالطرد المركزي (4000 دورة في الدقيقة ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية).أعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت للتحلل (50 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.0 ، 250 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 مم PMSF) واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة ، ثم صوتنة (15 دقيقة ، 5 ثوانٍ تشغيل / إيقاف ، على الجليد) وأجهزة الطرد المركزي (13000) دورة في الدقيقة).، 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية).تم بعد ذلك تحميل المادة الطافية على راتنج Ni-NTA (QIAGEN) 3 مرات عند 4 درجات مئوية ، وغسلها 4 مرات باستخدام محلول غسيل مؤقت (50 ملي مولار تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 40 ملي إيميدازول ، و 250 ملي مول كلوريد الصوديوم) وتم التصفية التتابعية 3 مرات ، بإجمالي من 10 مل من محلول eluent (50 ملي تريس ، درجة الحموضة 8.0 ، 250 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 300 ملي إيميدازول).تم تحديد البروتين المنقى باستخدام WB وتم تحديد التركيز باستخدام مجموعة فحص البروتين Qubit ™ (Thermo Fisher Scientific؛ Q 33212).
تم إجراء فحوصات RIP كما هو موضح سابقًا ، مع التعديلات.باختصار ، 1x RIP buffer (25 ملي مولار Tris-HCl ، pH 7.5 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ NP-40 ، مثبط RNasin ribonuclease (Promega) ، PMSF (Beyotime Biotechnology) ، 1 مم DDM ، البروتياز) lyses تثبيط الخلايا 1 × 107 كوكتيل (روش ، 1 مم DTT) وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.تم تحضين المادة الطافية بعد ذلك باستخدام حبيبات مغناطيسية من البروتين A + G (ميليبور) مترافقة مع 5 ميكروغرام من الجسم المضاد المضاد لـ PACT (Abeam) أو IgG (CST).تم غسل الحبيبات 5 مرات باستخدام محلول 5x RIP ، ثم هضمها بالبروتينيز K (NEB).تم استخراج الحمض النووي الريبي مع Trizol وتحديده بواسطة RT-qPCR.يتم عرض الاشعال في الجدول التكميلي 5.
تم إجراء اختبار RIP في المختبر وفقًا لبروتوكول اختبار RIP القياسي المعدل.تم تخفيف ما مجموعه 5 pmol من الحمض النووي الريبي المنسوخ في المختبر 1x باستخدام محلول RIP المؤقت وتم تعريضه للحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق متبوعًا بالتبريد البطيء إلى درجة حرارة الغرفة.تمت تنقية ما مجموعه 5 pmol من بروتينات PACT السليمة أو المتحولة التي تحمل علامة العلم من E. coli.احتضان مع الحمض النووي الريبي المعاد تشكيله لمدة 2 ساعات عند 4 درجات مئوية واتبع الإجراء أعلاه لتحليل RIP للملكية الفكرية المضادة للعلم.
لتحليل تمديد الحمض النووي الريبي ، تم تحليل 1 × 107 خلية باستخدام المخزن المؤقت 1xRIP.بعد الطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، تمت معالجة المادة الطافية مسبقًا بـ 30 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغناطيسية (بيكمان) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.تم بعد ذلك تزويد المحللة المنقى بـ tRNA الخميرة واحتضانها بـ 40 pmol من الحمض النووي الريبي المعاد تكوينه طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، ثم لمدة ساعتين أخريين وأضيف 20 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغناطيسية الجديدة المحجوبة بواسطة BSA.تتكون خطوة الغسيل من 4 مرات مع 5x RIP buffer و 4 مرات مع 1x RIP buffer.تمت إزالة البروتينات المقابلة باستخدام محلول شطف البيوتين (25 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 12.5 ملي مولار من البيوتين ، و PMSF) وتم فصلها على NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Gel (Invitrogen).بعد تلطيخ الفضة (Beyotime Biotechnology) ، تم استئصال بعض العصابات وتحليلها بواسطة MS.
تم إجراء تحليل Co-IP لاختبار التفاعل بين PACT و PKR.باختصار ، تم تحضير المحللات الطافية عن طريق احتضان 1 × 107 خلية مفسدة في محلول RIP 1 × متبوعًا بالطرد المركزي عند 13000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.تم تحميل Lysates بحبيبات مغناطيسية من البروتين A + G ، مقترنة بـ 5 ميكروغرام من الأجسام المضادة لـ PACT ، وتم تدويرها بلطف طوال الليل عند 4 درجات مئوية.تم غسل الخرزات 3 مرات بمخزن مؤقت 5 × RIP ، مرتين مع 1 × RIP عازلة وتم التصفية باستخدام 1 × SDS.تم تحليل البروتين المستعاد بواسطة هلام SDS-PAGE واكتشافه بواسطة WB.
تمت تنقية 2 pmol من PACT التي تم وضع علامة عليها و 1 pmol من PKR من E. coli.تمييع في المخزن المؤقت 1 × RIP واحتضان مع 10 pmol من الحمض النووي الريبي المعاد لساعتين عند 4 درجات مئوية.بعد ذلك ، تم تحضينهم مع البروتين A + G الأجسام المضادة المترافقة بالخرز المغناطيسي لمدة ساعتين إضافيتين.تم بعد ذلك غسل الخرزات أربع مرات باستخدام محلول RIP 1x وتم التصفية التتابعية باستخدام محلول SDS 1x.تم الكشف عن PACT و PKR الناتج بواسطة WB.