أخبار

شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
تُستخدم طرق وضع العلامات القربية الإنزيمية القائمة على الاسترات المنشطة أو جذور الفينوكسي على نطاق واسع لرسم خريطة للبروتينات تحت الخلوية ومتفاعلات البروتين في الخلايا الحية.ومع ذلك ، فإن الاسترات المنشطة أقل تفاعلًا ، مما يؤدي إلى نطاق واسع لوضع العلامات ، ويمكن أن تتداخل جذور الفينوكسي الناتجة عن العلاج بالبيروكسيد مع مسارات الأكسدة والاختزال.نُبلغ هنا عن طريقة التنشيط الضوئي المعتمد على وضع العلامات التقريبية (PDPL) التي تم تطويرها عن طريق الربط الجيني لبروتين المحسس الضوئي miniSOG ببروتين ذي أهمية.يتم تشغيله بواسطة الضوء الأزرق ويتم التحكم فيه عن طريق وقت التعرض ، ويتولد أكسجين القميص ثم يتم تحديد العلامات المكانية والزمانية لبقايا الهيستيدين بواسطة مسبار الأنيلين.نظهر دقتها العالية من خلال رسم خرائط البروتين الخاصة بالعضية.تُظهر مقارنة PDPL جنبًا إلى جنب مع TurboID تغطية بروتينية أكثر تحديدًا وشمولية لـ PDPL.بعد ذلك ، طبقنا PDPL على المنشط النسخي المرتبط بالمرض BRD4 و E3 Parkin ligase ووجدنا متفاعلات غير معروفة سابقًا.من خلال فحص الإفراط في التعبير ، تم تحديد ركيزتين غير معروفين ، Ssu72 و SNW1 ، لباركين ، الذي يتم التوسط في تدهوره بواسطة مسار التواجد البروتيازومي.
إن التوصيف الدقيق لشبكات البروتين يكمن وراء العديد من العمليات الخلوية الأساسية.لذلك ، فإن رسم الخرائط الزمانية المكانية عالية الدقة لتفاعلات البروتين سيوفر أساسًا جزيئيًا لفك تشفير المسارات البيولوجية ، وعلم أمراض الأمراض ، وتعطيل هذه التفاعلات للأغراض العلاجية.تحقيقا لهذه الغاية ، فإن الأساليب القادرة على اكتشاف التفاعلات الزمنية في الخلايا أو الأنسجة الحية مرغوبة للغاية.تم استخدام مقياس الطيف الكتلي للتنقية (AP-MS) تاريخيًا لتحديد الشركاء الملزمين للبروتينات ذات الأهمية (POIs).مع تطوير طرق البروتينات الكمية ، تم إنشاء Bioplex3.0 ، وهي أكبر قاعدة بيانات لشبكات البروتين القائمة على AP-MS.على الرغم من أن AP-MS قوي جدًا ، إلا أن خطوات تحلل الخلايا والتخفيف في سير العمل منحازة نحو تفاعلات الربط الضعيفة والعابرة وإدخال التحف ما بعد التحلل مثل أزواج التفاعل الزائفة التي تفتقر إلى التقسيم قبل التحلل.
لمعالجة هذه المشكلات ، تم تطوير أحماض أمينية غير طبيعية (UAA) مع مجموعات متشابكة ومنصات وضع العلامات الأنزيمية القريبة (PL) (مثل APEX و BioID) 5.على الرغم من أن طريقة UAA قد تم تطبيقها بنجاح في العديد من السيناريوهات وتوفر معلومات حول المواد اللاصقة البروتينية المباشرة ، إلا أن تحسين موقع إدخال UAA لا يزال مطلوبًا.والأهم من ذلك ، أنها طريقة وضع العلامات المتكافئة تفتقر إلى الانعكاس التحفيزي لوضع العلامات على الأحداث.على النقيض من ذلك ، فإن طرق PL الإنزيمية ، مثل طريقة BioID ، تدمج البيوتين يجاز المهندسة إلى POI7 ، والتي تنشط فيما بعد البيوتين لتشكيل إستر وسيط biotinyl-AMP التفاعلي.وبالتالي فإن الإنزيم يحفز ويطلق "سحابة" البيوتين المنشط التي تسمي بقايا اللايسين القريبة.ومع ذلك ، يتطلب BioID أكثر من 12 ساعة للحصول على إشارة معنونة كافية ، مما يحول دون استخدامها بدقة زمنية.باستخدام التطور الموجه القائم على عرض الخميرة ، تم تصميم TurboID استنادًا إلى BioID ليكون أكثر كفاءة ، مما يسمح بوضع العلامات الفعالة مع البيوتين في غضون 10 دقائق ، مما يسمح بدراسة المزيد من العمليات الديناميكية.نظرًا لأن TurboID نشط للغاية ومستويات البيوتين الذاتية كافية لوضع العلامات على المستوى المنخفض ، فإن وضع العلامات في الخلفية يصبح مشكلة محتملة عندما يكون وضع العلامات المحسن للغاية والوقت مطلوبًا عن طريق إضافة البيوتين الخارجي.بالإضافة إلى ذلك ، تكون الإسترات المنشطة ضعيفة التفاعل (t1 / 2 ~ 5 min) ، مما قد يؤدي إلى نصف قطر كبير لوضع العلامات ، خاصة بعد تشبع البروتينات المجاورة بالبيوتين 5. في نهج آخر ، الاندماج الجيني لبيروكسيديز الأسكوربات الهندسي (أي البيوتين- جذور الفينول ويسمح بوضع العلامات على البروتين في غضون دقيقة 9،10. يستخدم APEX على نطاق واسع لتحديد البروتينات تحت الخلوية ومجمعات البروتين الغشائي ومجمعات بروتين الإشارة الخلوية 11،12. ومع ذلك ، يمكن أن تؤثر الحاجة إلى تركيزات عالية من البيروكسيدات على بروتينات الأكسدة والاختزال أو مسارات العمليات الخلوية.
وبالتالي ، فإن الطريقة الجديدة القادرة على توليد المزيد من أنواع قمع نصف القطر المسمى تفاعلية مع دقة مكانية وزمنية عالية دون تعطيل المسارات الخلوية بشكل كبير ستكون إضافة مهمة للطرق الحالية. من بين الأنواع التفاعلية ، أثار الأكسجين القميص انتباهنا بسبب قصر عمره ونصف قطر الانتشار المحدود (t1 / 2 <0.6 s في الخلايا). من بين الأنواع التفاعلية ، أثار الأكسجين القميص انتباهنا بسبب قصر عمره ونصف قطر الانتشار المحدود (t1 / 2 <0.6 s في الخلايا). Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. من بين الأشكال النشطة ، جذب الأكسجين القميص انتباهنا نظرًا لعمره القصير ونصف قطر الانتشار المحدود (t1 / 2 <0.6 s في الخلايا) 13.在 活性 物质 中 ， 单线 态 氧 因其 寿命 短 和 扩散 半径 有限 （细胞 中 t1 / 2 <0.6 µs） 而 引起 了 我们 的 注意 13。 1/2 <0.6 µs） 而 引起 了 我们 的 注意 13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). من بين الأشكال النشطة ، يجذب الأكسجين القميص انتباهنا بسبب عمره القصير ونصف قطر الانتشار المحدود (t1 / 2 <0.6 μs في الخلايا).تم الإبلاغ عن أكسجين Singlet لأكسدة الميثيونين والتيروزين والهيستيدين والتربتوفان عشوائياً ، مما يجعله قطبي 14،15 للتعلق بالأمين أو المجسات القائمة على الثيول.على الرغم من استخدام الأكسجين المفرد لتسمية الحمض النووي الريبي للمقصورة الفرعية الخلوية ، إلا أن استراتيجيات إعادة تحديد الغرض من علامات قرب نقاط الاهتمام الداخلية لا تزال غير مستكشفة.هنا ، نقدم منصة تسمى وسم القرب المعتمد على التنشيط الضوئي (PDPL) ، حيث نستخدم الضوء الأزرق لإلقاء الضوء على نقاط الاهتمام المدمجة مع جهاز التحسس الضوئي miniSOG وتحفيز توليد الأكسجين المفرد لأكسدة المخلفات القريبة ، متبوعًا بتعديلات تحتوي على أمين لأكسدة المجسات الكيميائية في خلايا حية وسيطة..اختبرنا مجموعة من المجسات الكيميائية لتعظيم خصوصية العلامة وتحديد مواقع التعديل باستخدام سير عمل البروتينات المفتوحة.تُظهر مقارنة PDPL جنبًا إلى جنب مع TurboID تغطية بروتينية أكثر تحديدًا وشمولية لـ PDPL.طبقنا هذا النهج على الواسمات الخاصة بالعضيات للبروتين تحت الخلوي وتحديد البروتين العام للشركاء الملزمين للبروتين التنظيمي اللاجيني المرتبط بالسرطان BRD4 و E3 ligase Parkin المرتبط بمرض باركنسون ، والذي أكد وجود شبكة معروفة وغير معروفة من البروتين. التفاعلات..تمثل قدرة PDPL على التعرف على ركائز E3 في مجمعات البروتين الكبيرة حالة تتطلب التعرف على الروابط غير المباشرة.تم تأكيد ركيزتين غير معروفتين من ركائز باركين بوساطة انتشار البروتيازوم في الموقع.
العلاج الضوئي (PDT) 19 وتعطيل الليزر بمساعدة الكروموفور (CALI) 20 ، حيث يولد تشعيع الضوء باستخدام محسّسات ضوئية الأكسجين المفرد ، ويمكن أن يعطل البروتينات المستهدفة أو يتسبب في موت الخلايا.نظرًا لأن الأكسجين المفرد مادة شديدة التفاعل مع مسافة انتشار نظرية تبلغ حوالي 70 نانومتر ، فيمكن التحكم في الأكسدة المحدودة مكانيًا حول المحسس الضوئي.بناءً على هذا المفهوم ، قررنا استخدام الأكسجين القميص لتحقيق تصنيف وثيق لمجمعات البروتين في الخلايا الحية.لقد قمنا بتطوير نهج البروتين الكيميائي PDPL لتحقيق أربع وظائف: (1) لتحفيز توليد الأكسجين القميص النشط على غرار النهج الإنزيمي PL ؛(2) توفير علامات تم حلها زمنيًا عند بدء الضوء ؛(3) عن طريق التغيير (4) تجنب استخدام العوامل المساعدة الداخلية (مثل البيوتين) لتقليل الخلفية ، أو استخدام الكواشف الخارجية المزعجة للغاية (مثل البيروكسيدات) لتقليل تعرض الخلية للإجهاد البيئي.
يمكن تقسيم محسّسات الضوء إلى فئتين بما في ذلك مركبات الفلور ذات الوزن الجزيئي الصغير (على سبيل المثال ، الورد البنغال والأزرق الميثيلين) 22 والبروتينات الصغيرة المشفرة وراثيًا (مثل miniSOG و KillerRed) 23.لتحقيق تصميم معياري ، قمنا بتطوير منصة PDPL من الجيل الأول عن طريق إضافة بروتينات المحسس الضوئي (PS) إلى POI24،25 (الشكل 1 أ).عند تعرضه للإشعاع بالضوء الأزرق ، يؤكسد الأكسجين المفردة بقايا الأحماض الأمينية القريبة من النواة ، مما يؤدي إلى قطبية محبة للكهرباء ويمكن أن تتفاعل بشكل أكبر مع الكائنات النووية لمسبار الأمين.تم تصميم المسبار بمقبض ألكين للسماح بنقر الكيمياء والسحب لأسفل لتوصيف LC / MS / MS.
رسم توضيحي تخطيطي لوضع العلامات على مجمعات البروتين بوساطة miniSOG.عند تعرضها للضوء الأزرق ، تولد الخلايا التي تعبر عن miniSOG-POI الأكسجين المفرد ، والذي يعدل البروتينات المتفاعلة ولكن ليس البروتينات غير المرتبطة.يتم اعتراض المنتجات الوسيطة للأكسدة الضوئية عن طريق تسميات الترحيل للمسبار الكيميائي الأمين لتشكيل المقاربات التساهمية.تسمح مجموعة الألكينيل الموجودة في المسبار الكيميائي بالنقر فوق الكيمياء للتخصيب عن طريق السحب لأسفل متبوعًا بتقدير LC-MS / MS.(ب) التركيب الكيميائي لمجسات الأمين 1-4.ج تحليل هلام الفلورسنت التمثيلي للعلامات البروتينية الموضعية في الميتوكوندريا باستخدام مجسات 1-4 والتقدير النسبي بناءً على قياس كثافة الهلام.تم تقييم نسبة الإشارة إلى الخلفية للمسبارات الكيميائية باستخدام تجارب التحكم السلبية باستثناء الضوء الأزرق أو استخدام خلايا HEK293T بدون تعبير miniSOG.ن = عينتان مستقلتان بيولوجيًا.تمثل كل نقطة نسخة طبق الأصل بيولوجية.د الكشف التمثيلي والتقدير الكمي لـ PDPL باستخدام التحقيق الأمثل 3 في وجود أو عدم وجود مكونات PDPL المشار إليها مثل c.ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا.تمثل كل نقطة نسخة طبق الأصل بيولوجية.تمثل الخطوط المركزية والشعيرات المتوسط ​​و ± الانحراف المعياري.مصرف البحرين المركزي: كوماسي بريليانت بلو.e التصوير المتحد البؤر للأكسجين القميص مع صبغة Si-DMA الحمراء البعيدة.شريط النطاق: 10 ميكرومتر.تم تكرار التصوير الهلامي والتجارب (كنفوكل) بشكل مستقل مرتين على الأقل مع نتائج مماثلة.
اختبرنا أولاً قدرة المحسّسات الناضجة للضوء miniSOG26 و KillerRed23 ، المعبر عنها بثبات في HEK293T ، للتوسط في وضع العلامات على البروتارجيلامين للبروتين كمسبار كيميائي (الشكل التكميلي 1 أ).أظهر تحليل مضان الهلام أن وضع العلامات البروتينية بالكامل قد تم باستخدام miniSOG وتشعيع الضوء الأزرق ، بينما لم يلاحظ أي منتج مرئي مع KillerRed.لتحسين نسبة الإشارة إلى الخلفية ، قمنا بعد ذلك باختبار مجموعة من المجسات الكيميائية التي تحتوي على الأنيلين (1 و 3) أو بروبيل أمين (2) أو بنزيل أمين (4).لاحظنا أن خلايا HEK293T نفسها لديها إشارة خلفية أعلى مقارنة بعدم وجود ضوء أزرق ، ربما بسبب المحسس الضوئي للريبوفلافين الداخلي ، أحادي نيوكليوتيد الفلافين (FMN). أعطت المجسات الكيميائية القائمة على الأنيلين 1 و 3 خصوصية أفضل ، حيث أظهر HEK293T بثبات miniSOG في الميتوكوندريا التي تعرض زيادة بمقدار 8 أضعاف في إشارة المسبار 3 ، بينما المسبار 2 المستخدم في طريقة وضع العلامات RNA CAP-seq يعرض فقط 2.5- زيادة إشارة أضعاف ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تفضيلات التفاعل المختلفة بين RNA والبروتين (الشكل 1 ب ، ج). أعطت المجسات الكيميائية القائمة على الأنيلين 1 و 3 خصوصية أفضل ، حيث أظهر HEK293T بثبات miniSOG في الميتوكوندريا التي تعرض زيادة بمقدار 8 أضعاف في إشارة المسبار 3 ، بينما المسبار 2 المستخدم في طريقة وضع العلامات RNA CAP-seq يعرض فقط 2.5- زيادة إشارة أضعاف ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تفضيلات التفاعل المختلفة بين RNA والبروتين (الشكل 1 ب ، ج).أظهرت المجسات الكيميائية القائمة على الأنيلين 1 و 3 خصوصية أفضل: يُظهر HEK293T ، الذي يعبر بشكل ثابت عن miniSOG في الميتوكوندريا ، زيادة أكثر من 8 أضعاف في إشارة المسبار 3 ، بينما المسبار 2 ، المستخدم في طريقة وضع العلامات CAP-seq RNA ، فقط يُظهر زيادة في الإشارة بمقدار 2.5 ضعفًا ، ربما بسبب تفضيلات التفاعل المختلفة بين RNA والبروتين (الشكل 1 ب ، ج).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更好 的 特异性 ， HEK293T 在 线粒体 中 稳定 表达 miniSOG ， 探针 3 信号 增加> 8 倍 ， 而 用于 RNA 标记 方法 CAP-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ 2.5- 倍 信号 增加 ， 可能 是 由于 RNA 和 蛋白质 之间 的 不同 反应 偏好 （图 1b ， c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， hek293t 在 粒 体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ 2.5 - 倍 信号 增加 ， 可能 是 由于 RNAكان للتحقيقات الكيميائية القائمة على الأنيلين 1 و 3 خصوصية أفضل ، وعبر HEK293T بثبات عن miniSOG في الميتوكوندريا ، وكان المسبار 3 أكثر من 8 أضعاف في الإشارة ، بينما أظهر المسبار 2 لطريقة وضع العلامات CAP-seq RNA زيادة 2.5 ضعف فقط.في الإشارة ، ربما بسبب تفضيلات التفاعل المختلفة بين RNA والبروتين (الشكل 1 ب ، ج).بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار مسبار 3 أيزومرات ومسبار الهيدرازين (تحقيقات 5 ، 6 ، 7) ، مما يؤكد تحسين المسبار 3 (الشكل التكميلي 1 ب ، ج).وبالمثل ، كشف تحليل التألق داخل الهلام عن معلمات تجريبية محسّنة أخرى: الطول الموجي للإشعاع (460 نانومتر) ، وتركيز المسبار الكيميائي (1 مم) ، ووقت التشعيع (20 دقيقة) (الشكل التكميلي 2 أ-ج).أدى حذف أي مكون أو خطوة في بروتوكول PDPL إلى انعكاس إشارة كبير إلى الخلفية (الشكل 1 د).والجدير بالذكر أنه تم تقليل وضع العلامات على البروتين بشكل كبير في وجود أزيد الصوديوم أو ترولوكس ، المعروفين بإخماد أكسجين القميص.يعزز وجود D2O ، المعروف بتثبيته للأكسجين القمري ، إشارة التوسيم.للتحقيق في مساهمة أنواع الأكسجين التفاعلية الأخرى في وضع العلامات ، تمت إضافة مانيتول وفيتامين ج لإنشاء كاسحات جذرية للهيدروكسيل والأكسيد الفائق ، على التوالي ، 18 ، 29 ، ولكن لم يتم العثور عليها لتقليل وضع العلامات.لم تؤد إضافة H O ، ولكن ليس الإضاءة ، إلى وضع العلامات (الشكل التكميلي 3 أ).أكد تصوير الأكسجين المفردة الفلورية باستخدام مجسات Si-DMA وجود الأكسجين القميص في سلك HEK293T-miniSOG ، ولكن ليس في سلك HEK293T الأصلي.بالإضافة إلى ذلك ، لم يستطع mitoSOX Red اكتشاف إنتاج الأكسيد الفائق بعد الإضاءة (الشكل 1 هـ والشكل التكميلي 3 ب) 30. تشير هذه البيانات بقوة إلى أن الأكسجين المفرد هو نوع الأكسجين التفاعلي الرئيسي المسؤول عن وضع العلامات البروتينية اللاحقة.تم تقييم السمية الخلوية لـ PDPL بما في ذلك إشعاع الضوء الأزرق والتحقيقات الكيميائية ، ولم يلاحظ أي سمية خلوية كبيرة (الشكل التكميلي 4 أ).
من أجل دراسة آلية وضع العلامات وتمكين التعرف البروتيني لمجمعات البروتين باستخدام LC-MS / MS ، نحتاج أولاً إلى تحديد الأحماض الأمينية التي تم تعديلها وكتلة دلتا لملصقات المسبار.تم الإبلاغ عن الميثيونين والهيستيدين والتريبتوفان والتيروزين عن طريق الأكسجين المفرد.نقوم بدمج سير العمل TOP-ABPP31 مع البحث المفتوح غير المتحيز الذي توفره منصة الحوسبة FragPipe القائمة على MSFragger32.بعد تعديل الأكسجين القميص ووضع العلامات على المسبار الكيميائي ، تم إجراء كيمياء النقر باستخدام ملصق تخفيض البيوتين الذي يحتوي على رابط قابل للانقسام ، متبوعًا بتمديد النيوترافيدين وهضم التربسين.تم فصل الببتيد المعدل ، الذي لا يزال مرتبطًا بالراتنج ، لتحليل LC-MS / MS (الشكل 2 أ والبيانات التكميلية 1).حدث عدد كبير من التعديلات في جميع أنحاء البروتين مع أكثر من 50 خريطة الببتيد (PSM) المطابقة المدرجة (الشكل 2 ب).من المثير للدهشة أننا لاحظنا فقط تعديل الهيستيدين ، ربما بسبب التفاعل العالي للحامض المؤكسد تجاه تحقيقات الأنيلين أكثر من الأحماض الأمينية الأخرى.وفقًا للآلية المنشورة لأكسدة الهيستيدين بالأكسجين المفرد ، 21،33 بنية كتلة دلتا المقترحة لـ +229 دا تتوافق مع مقرب المسبار 3 مع 2-أوكسو هيستيدين بعد تأكسدين ، بينما +247 دا هو منتج التحلل المائي من +229 Da (الشكل التكميلي 5).أظهر تقييم طيف MS2 موثوقية عالية لتحديد معظم أيونات y و b ، بما في ذلك تحديد أيونات الشظايا المعدلة (y و b) (الشكل 2 ج).كشف تحليل السياق للتسلسل المحلي للهستيدينات المعدلة بـ PDPL عن تفضيل معتدل لعزر البقايا الصغيرة الكارهة للماء في مواضع ± 1 (الشكل التكميلي 4 ب).في المتوسط ​​، تم تحديد 1.4 هيستيدين لكل بروتين ، وتم تحديد مواقع هذه العلامات من خلال مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها بالمذيب (SASA) وتحليل توافر المذيبات النسبي (RSA) (الشكل التكميلي 4 ج ، د).
سير عمل غير متحيز لدراسة الانتقائية المتبقية باستخدام منصة الحوسبة FragPipe المدعومة من MSFragger.تُستخدم الوصلات القابلة للانقسام في كيمياء النقر للسماح بالفصل الضوئي للببتيدات المعدلة من راتينج الستربتافيدين.تم إطلاق بحث مفتوح لتحديد العديد من التعديلات ، بالإضافة إلى البقايا ذات الصلة.ب قم بتعيين كتلة التعديلات التي تحدث في جميع أنحاء البروتين.رسم خرائط الببتيد PSM.c التعليق التوضيحي الطيفي MS2 لمواقع الهيستيدين المعدل باستخدام المسبار 3. كمثال تمثيلي ، أضاف التفاعل التساهمي مع المسبار 3 +229.0938 Da إلى الحمض الأميني المعدل.د مقايسة الطفرة المستخدمة لاختبار علامات PDPL.تم نقل PRDX3 (H155A ، H225A) و PRDX1 (H10A ، H81A ، H169A) باستخدام بلازميدات من النوع البري للكشف عن العلم المضاد.تم تفاعل الببتيد الاصطناعي مع miniSOG المنقى في وجود المسبار 3 ولوحظت المنتجات المقابلة مع Δm +247 و +229 في طيف LC-MS.f تفاعلات البروتين إلى البروتين في المختبر المصممة على غرار miniSOG-6xHis-tag والجسم المضاد لـ 6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) وتحليل اللطخة الغربية المضادة للفأر لمجمعات الأجسام المضادة miniSOG-6xHis / anti-6xHis المسمى المسبار 3 ، اعتمادًا على وقت التعرض للضوء.يتم التعبير عن تسميات البروتينات الفردية بالوزن الجزيئي المقابل: السلسلة الخفيفة للجسم المضاد LC ، السلسلة الثقيلة للجسم المضاد HC.تم تكرار هذه التجارب بشكل مستقل مرتين على الأقل مع نتائج مماثلة.
من أجل التحقق الكيميائي الحيوي لموقع وضع العلامات ، تم تغيير PRDX3 و PRDX1 المحدد بواسطة قياس الطيف الكتلي من الهيستيدين إلى الألانين ومقارنته بالنوع البري في فحوصات تعداء.أظهرت نتائج PDPL أن الطفرة قللت بشكل كبير من وضع العلامات (الشكل 2 د).وفي الوقت نفسه ، تم تصنيع تسلسلات الببتيد التي تم تحديدها في البحث المفتوح وتفاعلت في المختبر مع miniSOG المنقى في وجود المسبار 3 والضوء الأزرق ، مما أسفر عن منتجات ذات تحول جماعي قدره +247 و +229 Da عند اكتشافها بواسطة LC-MS (الشكل 1 ب). . 2e).).لاختبار ما إذا كان يمكن تمييز البروتينات القريبة المتفاعلة في المختبر استجابةً للتنشيط الضوئي لـ miniSOG ، قمنا بتصميم مقايسة تقارب اصطناعي من خلال التفاعل بين بروتين miniSOG-6xHis والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد له في المختبر (الشكل 2f).في هذا الاختبار ، توقعنا وضع العلامات القريبة على سلاسل الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة باستخدام miniSOG.في الواقع ، أظهر مضاد الفأر (التعرف على السلاسل الثقيلة والخفيفة للأجسام المضادة التي تحمل علامة 6xHis) والبقع الغربية streptavidin ارتباطًا حيويًا قويًا للسلاسل الثقيلة والخفيفة.على وجه الخصوص ، لاحظنا عملية biotinylation miniSOG بسبب علامة 6xHis والصلات المتقاطعة بين السلاسل الخفيفة والثقيلة ، والتي قد تكون مرتبطة بالفجوة الموصوفة سابقًا بين استجابة اللايسين و 2-أوكسو-هيستيدين القريبة.في الختام ، نستنتج أن PDPL يعدل الهيستيدين بطريقة تعتمد على القرب.
كان هدفنا التالي هو توصيف البروتين الخلوي لاختبار خصوصية وضع العلامات في الموقع.لذلك ، عبرنا بثبات عن miniSOG في النواة ، أو مصفوفة الميتوكوندريا ، أو الغشاء ER الخارجي لخلايا HEK293T (الشكل 3 أ).كشف تحليل مضان الهلام عن نطاقات ذات علامات وفيرة في ثلاثة مواقع دون خلوية بالإضافة إلى أنماط مختلفة لوضع العلامات (الشكل 3 ب).أظهر تحليل التصوير الفلوري خصوصية عالية من PDPL (الشكل 3 ج).تبع سير عمل PDPL تفاعلات النقر مع أصباغ رودامين لتحديد البروتينات دون الخلوية باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، وتم تنسيق إشارات PDPL باستخدام DAPI أو متتبعات الميتوكوندريا أو متتبعات ER ، مما يؤكد الدقة العالية لـ PDPL.بالنسبة لمواقع العضية الثلاثة ، أظهرت مقارنة جنبًا إلى جنب لـ PDPL مع TurboID باستخدام لطخة أفيدين الغربية أن PDPL تم تصنيفها بشكل أكثر تحديدًا مقارنةً بعناصر التحكم الخاصة بها.في ظل ظروف PDPL ، ظهر المزيد من النطاقات ذات العلامات ، مما يشير إلى المزيد من البروتينات التي تحمل علامة PDPL (الشكل التكميلي 6 أ-د).
تمثيل تخطيطي لوضع العلامات البروتينية الخاصة بالعضيات بوساطة miniSOG.يستهدف miniSOG مصفوفة الميتوكوندريا عبر الاندماج إلى 23 من الأحماض الأمينية N-terminal 23 من COX4 البشري (mito-miniSOG) ، والنواة عبر الاندماج إلى H2B (nucleus-miniSOG) ، و Sec61β عبر الجانب السيتوبلازمي من غشاء ER (ER-miniSOG) ).تشمل المؤشرات التصوير الهلامي والتصوير المتحد البؤر وقياس الطيف الكتلي.ب صور جل تمثيلية لثلاثة ملفات تعريف PDPL خاصة بالعضيات.مصرف البحرين المركزي كوماسي بريليانت بلو.ج صور تمثيلية متحد البؤر لخلايا HEK293T تعبر بثبات عن miniSOG مع مواضع خلوية مختلفة تم اكتشافها بواسطة جسم مضاد مُسمى V5 (أحمر).تستخدم العلامات الخلوية للميتوكوندريا و ER (الأخضر).يتضمن سير عمل PDPL اكتشاف البروتينات الخلوية المسمى miniSOG (الأصفر) باستخدام كيمياء النقر فوق Cy3-azide.شريط النطاق: 10 ميكرومتر.د المؤامرات البركانية للبروتينات الموسومة بـ PDPL في عضيات مختلفة محددة كمياً عن طريق القياس الكمي غير المسماة (ن = 3 تجارب بيولوجية مستقلة).تم استخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل في قطع البركان.تم استخدام النوع البري HEK293T كعنصر تحكم سلبي. يتم تمييز البروتينات التي تم تغييرها بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف فرق كثافة الأيونات). يتم تمييز البروتينات التي تم تغييرها بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف فرق كثافة الأيونات). начительно измененные белки выделены красным ветом (p <0،05 и> 2-кратная разница в интенсивноости). يتم تمييز البروتينات المعدلة بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف الفرق في كثافة الأيونات).显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异）。显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （ف <0.05 和> 2 начительно измененные белки выделены красным ветом (p <0،05 и> 2-кратная разница в ионной силе). يتم تمييز البروتينات المعدلة بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف الفرق في القوة الأيونية).تظهر البروتينات ذات الصلة المهمة لـ HEK293T-miniSOG ولكنها غير مهمة لـ HEK293T باللون الأخضر.هـ تحليل خصوصية مجموعات البيانات البروتينية من التجارب د.يتم تمييز العدد الإجمالي للبروتينات ذات الدلالة الإحصائية في كل عضية (النقاط الحمراء والخضراء) في الأعلى.تُظهر الرسوم البيانية البروتينات المترجمة في العضيات بناءً على تحليل MitoCarta 3.0 و GO و A. Ting et al.اشخاص.مجموعات بيانات منفصلة للميتوكوندريا والنواة و ER.تم تكرار هذه التجارب بشكل مستقل مرتين على الأقل مع نتائج مماثلة.يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.
بتشجيع من نتائج الجل والتصوير ، تم استخدام القياس الكمي الخالي من الملصقات لتحديد البروتين المحدد في كل عضية (البيانات التكميلية 2).تم استخدام HEK293T غير المنقولة كعنصر تحكم سلبي لطرح علامات الخلفية. عرض تحليل مخطط البركان بروتينات مخصبة بشكل كبير (p <0.05 و> شدة أيون 2 أضعاف) بالإضافة إلى بروتينات أحادية موجودة فقط في خطوط التعبير عن miniSOG (الشكل ثلاثي الأبعاد نقاط حمراء وخضراء). عرض تحليل مخطط البركان بروتينات مخصبة بشكل كبير (p <0.05 و> شدة أيون 2 أضعاف) بالإضافة إلى بروتينات أحادية موجودة فقط في خطوط التعبير عن miniSOG (الشكل ثلاثي الأبعاد نقاط حمراء وخضراء). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). أظهر تحليل مؤامرة البركان بروتينات مخصبة بشكل كبير (p <0.05 و> كثافة أيون 2 أضعاف) بالإضافة إلى بروتينات مفردة موجودة فقط في خطوط التعبير عن miniSOG (الشكل ثلاثي الأبعاد ، النقاط الحمراء والخضراء).火山 图 分析 显示 出 显 着 富集 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 以及 仅存 miniSOG 表达 系 中 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 和 绿色 点）。火山 图 分析 显示 出 显 着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 的 单一 蛋白质 （图 绿色 点 。。。）））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). كشف تحليل مخطط البركان عن بروتينات مخصبة بشكل كبير (p <0.05 و> 2x قوة أيونية) بالإضافة إلى بروتينات مفردة موجودة فقط في خط تعبير miniSOG (النقاط الحمراء والخضراء في الشكل ثلاثي الأبعاد).بدمج هذه البيانات ، حددنا 1364 و 461 و 911 بروتينات غشاء خارجي ذات دلالة إحصائية نووي وميتوكوندريا و ER ، على التوالي.لتحليل دقة PDPL المترجمة للعضيات ، استخدمنا MitoCarta 3.0 ، وتحليل علم الوجود الجيني (GO) ، و A. Ting et al.تم استخدام مجموعة بيانات 8 للميتوكوندريا والنواة و ER لاختبار خصوصية العضية للبروتينات المكتشفة ، والتي تقابل دقة 73.4 و 78.5 و 73.0٪ (الشكل 3 هـ).تؤكد خصوصية PDPL أن PDPL هي أداة مثالية لتحديد البروتينات الخاصة بالعضيات.والجدير بالذكر أن التحليل تحت الميتوكوندريا لبروتينات الميتوكوندريا المحددة أظهر أن البروتين المحاصر تم توزيعه بشكل أساسي في المصفوفة والغشاء الداخلي (226 و 106 ، على التوالي) ، وهو ما يمثل 91.7٪ (362) من العدد الإجمالي لبروتينات الميتوكوندريا المحددة.تم تأكيد مستوى عالٍ من PDPL بشكل إضافي (الشكل التكميلي 7 أ).وبالمثل ، أظهر التحليل تحت النواة أن البروتين الذي تم التقاطه تم توزيعه بشكل أساسي في النواة ، والبلازما النووية ، والنواة (الشكل التكميلي 7 ب).أظهر التحليل البروتيني النووي باستخدام ببتيد إشارة التوطين النووي (3xNLS) دقة مماثلة لتركيب H2B (الشكل التكميلي 7c-h).لتحديد خصوصية علامة PDPL ، تم اختيار اللامينين النووي A كمصيدة POI7 مترجمة بشكل أكثر تفصيلاً.حدد PDPL 36 بروتينًا مخصبًا بشكل كبير ، منها 12 بروتينًا (30.0٪ بما في ذلك lamin A) كانت بروتينات تفاعلية جيدة التوصيف lamin A تم شرحها بواسطة قاعدة بيانات String ، مع نسبة مئوية أعلى من طريقة BioID (122 بروتينًا) 28 من 28. ، 22.9 ٪) 7. طريقتنا حددت عددًا أقل من البروتينات ، ربما بسبب مناطق العلامات المحدودة ، والتي أصبحت ممكنة بفضل الأكسجين المفرد الأكثر نشاطًا.أظهر تحليل GO أن البروتينات المحددة كانت موجودة بشكل أساسي في nucleoplasm (26) ، والغشاء النووي (10) ، والغشاء النووي (9) ، والمسام النووية (5).بشكل جماعي ، شكلت هذه البروتينات المترجمة نوويًا 80 ٪ من البروتينات المخصبة ، مما يدل على خصوصية PDPL (الشكل التكميلي 8 أ-د).
بعد أن أثبتنا قدرة PDPL على أداء علامات التقارب في العضيات ، قمنا بعد ذلك باختبار ما إذا كان يمكن استخدام PDPL لتحليل شركاء ربط POI.على وجه الخصوص ، سعينا إلى تحديد تحليل PDPL لبروتينات العصارة الخلوية ، والتي تعتبر أهدافًا أكثر صعوبة من نظيراتها الغشائية المحلية نظرًا لطبيعتها الديناميكية للغاية.جذب بروتين البرومودومين والبروتين الخارجي (BET) BRD4 انتباهنا لدوره الرئيسي في الأمراض المختلفة 35 ، 36.المركب المكون من BRD4 هو مُنشِط نسخي وهدف علاجي مهم.من خلال تنظيم التعبير عن عوامل النسخ c-myc و Wnt5a ، يُعتقد أن BRD4 هو المحدد الرئيسي لسرطان الدم النخاعي الحاد (AML) والورم النخاعي المتعدد وسرطان الغدد الليمفاوية في بوركيت وسرطان القولون والأمراض الالتهابية.بالإضافة إلى ذلك ، تستهدف بعض الفيروسات BRD4 لتنظيم النسخ الفيروسي والخلوي ، مثل فيروس الورم الحليمي وفيروس نقص المناعة البشرية و SARS-CoV-236،39.
لتعيين تفاعل BRD4 باستخدام PDPL ، قمنا بدمج miniSOG مع شكل إسوي قصير N- أو C- من BRD4.كشفت النتائج البروتينية عن درجة عالية من التداخل بين التركيبتين (الشكل التكميلي 9 أ).يغطي البروتين النووي المحدد بـ miniSOG-H2B 77.6٪ من البروتينات التي تتفاعل مع BRD4 (الشكل التكميلي 9 ب).بعد ذلك ، تم استخدام أوقات مختلفة من الإضاءة (2 ، 5 ، 10 ، 20 دقيقة) لضبط نصف قطر العلامة (الشكل 4 أ والبيانات التكميلية 3).نستنتج أنه في الفترات الضوئية الأقصر ، ستقوم PDPL بتسمية شركاء الربط المباشر بشكل أساسي ، في حين أن الفترات الأطول ستشمل البروتينات المحددة خلال فترات التنشيط الضوئي الأقصر بالإضافة إلى الأهداف غير المباشرة في وضع العلامات على المجمعات.في الواقع ، وجدنا تداخلًا قويًا بين النقاط الزمنية المجاورة (84.6٪ لمدة 2 و 5 دقائق ؛ 87.7٪ لمدة 5 و 10 دقائق ؛ 98.7٪ لمدة 10 و 20 دقيقة) (الشكل 4 ب والشكل التكميلي 9 ج).في جميع المجموعات التجريبية ، وجدنا ليس فقط تسمية BRD4 الذاتية ، ولكن العديد من الأهداف المعروفة مثل MED1 و CHD8 و BICRA و NIPBL و SMC1A و HMGB1 مشروحة في قاعدة بيانات السلسلة.تتناسب القوة الأيونية لهذه الأهداف مع وقت التعرض (الشكل 4 ج والشكل التكميلي 9 د).أظهر تحليل GO للبروتينات التي تم تحديدها في المجموعة التي مدتها دقيقتان أن البروتينات المحددة كانت مترجمة في النواة وشاركت في إعادة تشكيل الكروماتين ووظيفة بوليميريز الحمض النووي الريبي.تم إثراء الوظيفة الجزيئية للبروتين في الارتباط بالكروماتين أو التنشيط النسخي ، بما يتوافق مع وظيفة BRD4 (الشكل 4 د).كشف تحليل تفاعل البروتين الذي تم تمكينه من خلال قاعدة بيانات السلسلة عن مستوى أول من التفاعلات غير المباشرة بين مجمعات تفاعل عائلة BRD4 و HDAC مثل SIN3A و NCOR2 و BCOR و SAP130 (الشكل 4 هـ والشكل التكميلي 9 هـ) ، بما يتوافق مع BRD4 و HDAC هيستونات أسيتيل ملزمة. ..بالإضافة إلى ذلك ، تم تأكيد الأهداف التمثيلية التي تم تحديدها بواسطة LC-MS / MS ، بما في ذلك Sin3A و NSUN2 و Fus و SFPQ ، بواسطة النشاف الغربي (الشكل 4f).في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن الشكل الإسوي القصير لـ BRD4 لتكوين نوى بخصائص فصل الطور السائل عن السائل (LLPS).تتوسط بروتينات ربط الحمض النووي الريبي Fus و SFPQ في LLPS للعمليات الخلوية المختلفة وقد تم تحديدها هنا كبروتينات ربط BRD4 غير مسجلة.تم تأكيد التفاعل بين BRD4 و SFPQ من خلال تجارب الترسيب المناعي المشترك (IP المشترك) (الشكل 4 ز) ، مما يشير إلى آلية أخرى لفصل الطور السائل عن السائل بوساطة BRD4 التي تستحق مزيدًا من التحقيق.مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن PDPL هي منصة مثالية لتحديد تفاعل BRD4 المعروف وكذلك بروتينات الربط غير المعروفة.
تمثيل تخطيطي لعلامات القرب BRD4 بوساطة miniSOG ، أوقات التعرض: 2 ، 5 ، 10 ، و 20 دقيقة.(ب) تداخل البروتينات المحددة في أوقات الإضاءة المختلفة.كان تخصيب البروتين المحدد في HEK293T-miniSOG-BRD4 ذا دلالة إحصائية مقارنةً بالنوع البري HEK293T.ج شدة الأيونات عند القياس الكمي لبروتينات ربط BRD4 التمثيلية غير المسماة خلال وقت التعرض المحدد.ن = 3 عينات مستقلة بيولوجيا.يتم تقديم البيانات على أنها تعني ± الانحراف المعياري.د التحليل الجيني الأنطولوجي (GO) للبروتينات المحددة في مجموعة دقيقتين.يتم سرد أول عشرة شروط GO.يتم تلوين الفقاعات وفقًا لفئة مصطلح GO ، ويتناسب حجم الفقاعة مع عدد البروتينات الموجودة في كل مصطلح.ه تحليل سلسلة من البروتينات التي تتفاعل مع BRD4.الدوائر الصفراء عبارة عن غراء مباشر والدوائر الرمادية هي الطبقة الأولى من الغراء غير المباشر.تمثل الخطوط الحمراء التفاعلات المحددة تجريبياً وتمثل الخطوط الزرقاء التفاعلات المتوقعة.f تم التحقق من أهداف الربط التمثيلية BRD4 المحددة في LC-MS / MS بواسطة النشاف الغربي.تؤكد تجارب الترسيب المناعي المشترك التفاعل بين SFPQ و BRD4.تم تكرار هذه التجارب بشكل مستقل مرتين على الأقل مع نتائج مماثلة.يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.
بالإضافة إلى تحديد الأهداف المرتبطة بـ POI غير المسجلة ، نفترض أن PDPL ستكون مناسبة لتحديد ركائز الإنزيمات ، الأمر الذي يتطلب توصيف بروتينات الربط غير المباشرة في المجمعات الكبيرة للتعليق على ركائز غير مسجلة.باركين (المشفر بواسطة PARK2) هو E3 ligase ومن المعروف أن الطفرات في باركين تسبب مرض باركنسون (AR-JP) لدى الأطفال.بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف باركين بأنه ضروري للتلتهم (البلعمة الذاتية للميتوكوندريا) وإزالة أنواع الأكسجين التفاعلية.ومع ذلك ، على الرغم من تحديد العديد من ركائز باركين ، لا يزال دور باركين في هذا المرض غير واضح.لتوضيح ركائزها غير المميزة ، تم اختبار PDPL عن طريق إضافة miniSOG إلى الطرف N أو C من باركين.عولجت الخلايا باستخدام ناقل بروتون كربونيل السيانيد m-chlorophenylhydrazone (CCCP) لتنشيط باركين عبر مسار PINK1-Parkin.مقارنة بنتائج BRD4 PDPL الخاصة بنا ، كشف اندماج Parkin N-terminus عن مجموعة أكبر من البروتينات المستهدفة ، على الرغم من أنها غطت جزءًا أكبر من الطرف C (177 من 210) (الشكل 5 أ ، ب والبيانات التكميلية 4).تتوافق النتيجة مع التقارير التي تفيد بأن علامات N-terminal يمكنها تنشيط Parkin بشكل خاطئ.من المثير للدهشة أنه لم يكن هناك سوى 18 بروتينًا متداخلاً في بياناتنا مع نتائج AP-MS المنشورة لـ Parkin ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الاختلافات بين خطوط الخلايا وسير عمل البروتينات.بالإضافة إلى أربعة بروتينات معروفة (ARDM1 و HSPA8 و PSMD14 و PSMC3) تم تحديدها بطريقتين (الشكل 5 ج) 43.لمزيد من التحقق من صحة نتائج LC-MS / MS ، تم استخدام علاج PDPL والنشاف الغربي اللاحق لمقارنة نتائج اختبار الخلية الأصل HEK293T وخط N-terminal Parkin المستقر.تم اختبار الأهداف غير المعروفة سابقًا CDK2 و DUT و CTBP1 و PSMC4 باستخدام مادة رابطة معروفة ، DNAJB1 (الشكل 5 د).
مخطط بركان للبروتينات المتفاعلة مع الباركين في خلايا HEK293T مع miniSOG المعبر عنها بثبات مدمجة في الطرف N أو C من باركين (ن = 3 تجارب بيولوجية مستقلة).تم استخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل في قطع البركان.تم استخدام HEK293T كعنصر تحكم سلبي. يتم تمييز البروتينات التي تم تغييرها بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف فرق كثافة الأيونات). يتم تمييز البروتينات التي تم تغييرها بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف فرق كثافة الأيونات). начительно измененные белки выделены красным ветом (p <0،05 и> 2-кратная разница в интенсивноости). يتم تمييز البروتينات المعدلة بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف الفرق في كثافة الأيونات).显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度 差异）。显 着 变化 的 蛋白质 以 红色 突出 显示 （ف <0.05 和> 2 начительно измененные белки выделены красным ветом (p <0،05 и> 2-кратная разница в ионной силе). يتم تمييز البروتينات المعدلة بشكل كبير باللون الأحمر (P <0.05 و> 2 أضعاف الفرق في القوة الأيونية).تظهر البروتينات ذات الصلة المهمة لـ HEK293T-miniSOG ولكنها غير مهمة لـ HEK293T باللون الأخضر.ب مخطط Venn يوضح البروتينات المتداخلة بين التركيبات الطرفية N و C.يمكن أن تنشط علامات N-terminal بشكل شاذ مرض باركين وتؤدي إلى المزيد من البروتينات التي يمكن التعرف عليها.ج مخطط Venn يوضح البروتينات المتداخلة بين PDPL و AP-MS.يتم سرد المتفاعلات المعروفة ، بما في ذلك 4 من 18 بروتينًا متداخلاً و 11 من أصل 159 بروتينًا تم تحديدها على وجه التحديد في PDPL.د تم التحقق من الأهداف التمثيلية التي تم تحديدها بواسطة LC-MS / MS بواسطة النشاف الغربي.تم تحديد e Ssu72 و SNW1 على أنهما ركائز باركين غير مسجلة.تم نقل بلازميدات البروتين التي تحمل علامات FLAG إلى HEK293T و HEK293T-Parkin-miniSOG متبوعًا بعلاج CCCP في نقاط زمنية مختلفة.كان التدهور أكثر وضوحًا في خط باركين المفرط.f باستخدام مثبط البروتوزوم MG132 ، تم التأكيد على أن عملية تدهور Ssu72 و SNW1 تتم بوساطة تواجد البروتيازوم.تم تكرار هذه التجارب بشكل مستقل مرتين على الأقل مع نتائج مماثلة.يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.
والجدير بالذكر أن البروتينات التي تم تحديدها بواسطة PDPL يجب أن تشتمل على بروتينات مرتبطة بالباركن وركائزها.للكشف عن ركائز باركين غير المسجلة ، اخترنا سبعة بروتينات محددة (PUF60 و PSPC1 و UCHL3 و PPP1R8 و CACYBP و Ssu72 و SNW1) والبلازميدات المنقولة لفضح هذه الجينات إلى HEK293T الطبيعي والتعبير بثبات عن miniSOG-Parkin's HEK293T متبوعًا بمعالجة CCCP.تم تخفيض مستويات البروتينات Ssu72 و SNW1 بشكل ملحوظ في خط miniSOG-Parkin المستقر (الشكل 5 هـ).نتج عن العلاج بـ CCCP لمدة 12 ساعة أكبر تدهور في كلا الركيزتين.للتحقق مما إذا كان تدهور Ssu72 و SNW1 ينظمه تواجد البروتوزوم ، تمت إضافة مثبط البروتوزوم MG132 لتثبيط نشاط البروتوزوم ، وفي الواقع وجدنا أن عملية التحلل الخاصة بهم قد تم تثبيطها (الشكل 5f).تم تأكيد أهداف إضافية غير ركيزة كمتفاعلات Parkin باستخدام النشاف الغربي (الشكل التكميلي 10) ، والذي أظهر نتائج متسقة مع LC-MS / MS.في الختام ، فإن تكامل سير عمل PDPL مع التحقق من تعداء البروتين المستهدف يسمح بتحديد ركائز E3 ligase غير المسجلة.
لقد طورنا منصة مشتركة لوضع العلامات عن قرب تسمح لك بالتعرف على نقاط الاهتمام المتفاعلة في المكان والزمان.تعتمد المنصة على بروتين miniSOG المحسس للضوء ، والذي يبلغ حوالي 12 كيلو دالتون فقط ، أي أقل من نصف حجم إنزيم APEX2 الناضج (27 كيلو دالتون) وثلث حجم TurboID (35 كيلو دالتون).يجب أن يوسع الحجم الأصغر بشكل كبير نطاق التطبيقات لدراسة تفاعلات البروتين الصغيرة.هناك حاجة إلى مزيد من الاستكشاف لمُحسِسات ضوئية إضافية ، سواء كانت بروتينات مشفرة وراثيًا أو جزيئات صغيرة ، لزيادة العائد الكمي للأكسجين المفرد وتوسيع حساسية هذا النهج.بالنسبة للإصدار الحالي من miniSOG ، يمكن تحقيق دقة زمنية عالية باستخدام الإضاءة الزرقاء لتفعيل علامات التقارب.بالإضافة إلى ذلك ، أطلق وقت التعرض الأطول "سحابة" أكبر من الأكسجين القمري ، مما أدى إلى تعديل المزيد من بقايا الهيستيدين البعيدة ، وزيادة نصف قطر الوسم ، والقدرة على ضبط الدقة المكانية PDPL.اختبرنا أيضًا سبعة مجسات كيميائية لزيادة نسبة الإشارة إلى الخلفية واستكشفنا الآلية الجزيئية وراء هذا النهج.أكد سير العمل TOP-ABPP جنبًا إلى جنب مع البحث المفتوح غير المتحيز أن التعديلات حدثت فقط في الهيستيدين ولم يلاحظ أي بيئة مكروية متسقة لزيادة تعديلات الهيستيدين ، باستثناء التفضيل المعتدل للحامض الهيستدين في منطقة الحلقة.
تم استخدام PDPL أيضًا لتوصيف البروتينات دون الخلوية بخصوصية وتغطية بروتينية على الأقل يمكن مقارنتها بوسائل التقريب الأخرى وطرق التحقيق الكيميائية الخاصة بالعضوية.تم أيضًا استخدام علامات القرب بنجاح لتوصيف البروتينات السطحية والجسيمية والمرتبطة بالإفراز.نعتقد أن PDPL ستكون متوافقة مع هذه العضيات دون الخلوية.بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتحدي PDPL من خلال تحديد أهداف ارتباط بروتين عصاري خلوي أكثر تعقيدًا من البروتينات المرتبطة بالغشاء نظرًا لخصائصها الديناميكية ومشاركتها في تفاعلات زمنية أكثر.تم تطبيق PDPL على بروتينين ، المنشط النسخي BRD4 و ligase E3 Parkin المرتبط بالمرض.تم اختيار هذين البروتينين ليس فقط لوظائفهما البيولوجية الأساسية ، ولكن أيضًا لأهميتهما السريرية وإمكاناتهما العلاجية.بالنسبة لهذين الموقعين المهمين ، تم تحديد شركاء ربط معروفين وكذلك أهداف غير مسجلة.والجدير بالذكر أن البروتين المرتبط بفصل الطور SFPQ تم تأكيده بواسطة بروتوكول IP المشترك ، مما قد يشير إلى آلية جديدة ينظم من خلالها BRD4 (الشكل الإسوي القصير) LLPS.في الوقت نفسه ، نعتقد أن تحديد ركائز Parkin هو سيناريو يتطلب فيه تحديد المواد اللاصقة غير المباشرة.حددنا ركائز باركين غير معروفين وأكدنا تحللهما على طول مسار انتشار البروتياز.في الآونة الأخيرة ، تم تطوير استراتيجية محاصرة قائمة على الآلية لاكتشاف ركائز الهيدرولاز عن طريق محاصرة الإنزيمات لها.على الرغم من أن هذه طريقة قوية جدًا ، إلا أنها غير مناسبة لتحليل الركائز المشاركة في تكوين مجمعات كبيرة وتتطلب تكوين روابط تساهمية بين الإنزيم والركيزة.نتوقع أن يتم تمديد PDPL لدراسة مجمعات البروتين الأخرى وعائلات الإنزيم ، مثل عائلات deubiquitinase و metalloprotease.
تم تطوير شكل جديد من miniSOG ، يسمى SOPP3 ، مع تحسين إنتاج الأكسجين القميص.قارنا miniSOG مع SOPP3 ووجدنا أداء وضعًا محسنًا ، على الرغم من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ظلت دون تغيير (الشكل التكميلي 11).افترضنا أن تحسين SOPP3 (على سبيل المثال ، من خلال التطور الموجه) من شأنه أن يؤدي إلى بروتينات أكثر فاعلية للحساسية الضوئية تتطلب أوقاتًا ضوئية أقصر وبالتالي تسمح بالتقاط المزيد من العمليات الخلوية الديناميكية.والجدير بالذكر أن الإصدار الحالي من PDPL يقتصر على البيئة الخلوية لأنه يتطلب إضاءة زرقاء ولا يمكنه اختراق الأنسجة العميقة.هذه الميزة تحول دون استخدامها في دراسات النماذج الحيوانية.ومع ذلك ، فإن الجمع بين علم البصريات الوراثي مع PDPL يمكن أن يوفر فرصة لأبحاث الحيوانات ، وخاصة في الدماغ.بالإضافة إلى ذلك ، تزيل محسّسات الأشعة تحت الحمراء المصممة هندسيًا هذا القيد أيضًا.البحث جار حاليا في هذا المجال.
تم الحصول على خط الخلية HEK293T من ATCC (CRL-3216).تم اختبار خط الخلية سلبيًا لعدوى الميكوبلازما وتم تربيته في DMEM (Thermo ، # C11995500BT) مع 10 ٪ من مصل بقري جنيني (FBS ، Vistech ، # SE100-B) و 1 ٪ بنسلين / ستربتومايسين (Hyclone ، # SV30010).نمت في.
تم شراء 3-Aminophenylene (العينة 3) و (4-ethynylphenyl) methanamine (العينة 4) من Bidepharm.تم شراء Propylamine (المسبار 2) من المواد الكيميائية للطاقة.تم تصنيع N- (2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (المسبار 1) وفقًا للطرق المنشورة.
يسرد الجدول التكميلي 1 التركيبات الجينية المستخدمة في هذه الدراسة.تم استنساخ تسلسل miniSOG و KillerRed من بلازميد هدية من P. Zou (جامعة بكين).تم اشتقاق تسلسل استهداف مصفوفة الميتوكوندريا من 23 من الأحماض الأمينية الطرفية N من COX4 وتم استنساخها في المتجهات المشار إليها باستخدام مجموعة Gibson (Beyotime ، # D7010S).لاستهداف غشاء ونواة الشبكة الإندوبلازمية ، تم تضخيم الحمض النووي البشري SEC61B (NM_006808.3) (NEB ، # M0491L) بواسطة PCR من مكتبة cDNA لخلايا HEK293T ، و H2B DNA (تم التبرع بها من قبل D. Lin ، مختبر خليج Shenzhen) والمستنسخة ، كما ذكر أعلاه.ما لم يُذكر خلاف ذلك ، تم تضخيم جينات البروتين الأخرى المستخدمة في تعداء الخلايا وبناء خطوط خلوية مستقرة من مكتبة خلايا HEK293T (كدنا).تم استخدام G3S (GGGS) و G4S (GGGGS) كصلات بين بروتين الطعم و miniSOG.تمت إضافة علامة حلقية V5 (GKPIPNPLLGLDST) إلى بنيات الاندماج هذه.للتعبير في الثدييات ولتأسيس خط خلية مستقر ، تم استنساخ بنية اندماج miniSOG في ناقل pLX304 lentiviral.للتعبير البكتيري ، تم استنساخ miniSOG في ناقل pET21a المسمى 6xHis عند الطرف C.
تم زرع خلايا HEK293T عند 2.0 × 105 خلية لكل بئر في ستة أطباق جيدة وتم نقلها بعد 24 ساعة باستخدام البلازميدات الفيروسية المؤتلفة (2.4 ميكروغرام pLX304) وبلازميدات التغليف الفيروسي (1.5 ميكروغرام psPAX2 و 1.2 ميكروغرام pMD2.G) باستخدام Lipo8000 (Beyotime ، # C0533) ، انصهار حوالي 80٪.بعد ترنسفكأيشن بين عشية وضحاها ، تم تغيير الوسط واحتضانه لمدة 24 ساعة أخرى.تم جمع الفيروس بعد 24 و 48 و 72 ساعة.قبل إصابة خطوط الخلايا المستهدفة ، تمت تصفية الوسط الفيروسي من خلال مرشح 0.8 ميكرومتر (Merck ، # millex-GP) وأضيف بوليبرين (Solarbio ، # H8761) إلى تركيز 8 ميكروغرام / مل.بعد 24 ساعة ، تم السماح للخلايا بالتعافي عن طريق تغيير الوسط.تم اختيار الخلايا باستخدام 5 ميكروغرام / مل بلاستيدين (سولاربيو ، # 3513-03-9) للمقاطع الثلاثة الأولى كاختيار أقل صرامة.ثم استخدم 20 ميكروغرام / مل كنظام أكثر صرامة للمقاطع الثلاثة التالية.
تم زرع الخلايا في 12 غرفة بئر (Ibidi ، رقم 81201) بكثافة تقارب 20000 خلية لكل بئر.لتحسين التصاق خلايا HEK293T ، أضف 50 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين (Corning ، # 356008) مخفف في محلول ملحي بالفوسفات (PBS ، Sangon ، # B640435) عند 37 درجة مئوية.تم معالجة الغرف مسبقًا لمدة ساعة ثم إزالتها باستخدام برنامج تلفزيوني.بعد 24 ساعة ، تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، واحتضانها بمسبار 1 ملي مولار 3 في محلول ملح متوازن من Hanks (HBSS ، Gibco ، # 14025092) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، ثم حضنت بمصباح LED أزرق (460 نانومتر. ).) لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وتثبيتها بـ 4 ٪ فورمالدهايد في PBS (Sangon ، # E672002) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.تمت إزالة الفورمالديهايد الزائد من الخلايا الثابتة عن طريق الغسيل ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.تم بعد ذلك نفاذية الخلايا باستخدام 0.5 ٪ Triton X-100 (Sangon ، # A600198) في برنامج تلفزيوني وغسلها 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.ثم قم بإزالة الحجرة وأضف إلى كل عينة 25 ميكرولتر من خليط تفاعل النقر الذي يحتوي على 50 ميكرومتر من Cy3-azide (Aladdin ، # C196720) ، 2 مم CuSO4 (Sangon ، # A603008) ، 1 مم BTTAA (Confluore ، # BDJ-4) و 0.5 ملغ / مل من أسكوربات الصوديوم (علاء الدين ، رقم S105024) وحضنت لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد التفاعل المفاجئ ، تم غسل الخلايا ست مرات باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.05٪ توين -20 (Sangon ، # A600560) (PBST) ثم منعها بـ 5٪ BSA (Abcone ، # B24726) في PBST لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.
من أجل التلقيح المناعي ، تم تحضين الخلايا بأجسام مضادة أولية وفقًا للشروط المحددة: الماوس المضاد V5 علامة mAb (1: 500 ، CST ، # 80076) ، مضاد لـ Hsp60 مللي أمبير (1: 1000) ، ABclonal ، # A0564) ، جسم مضاد مضاد للكالنيكسين متعدد الأضلاع من الأرانب (1: 500 ، Abcam ، # ab22595) أو الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للصفائح A / C للأرنب (1: 500 ؛ CST ، # 2032) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.بعد الغسيل 3 مرات باستخدام PBST ، تم تحضين الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية: الماعز المضاد للأرنب Alexa Fluor 488 (Thermo ، # A11034) المخفف 1: 1000 ، الماعز المضاد للفأر Alexa Fluor 594 (CST ، # 8889) المخفف 1: 1000.مخفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.تم بعد ذلك غسل الخلايا 3 مرات باستخدام PBST وتمت مواجهتها باستخدام DAPI (Thermo ، # D1306) في PBS لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة.بعد 3 غسلات باستخدام برنامج تلفزيوني ، تم غلق الخلايا في 50٪ جلسرين (Sangon ، # A600232) في برنامج تلفزيوني للتصوير.تم الحصول على صور الفلورسنت المناعي باستخدام مجهر متحد البؤر ZEISS LSM 900 Airyscan2 وبرنامج ZNE 3.5.
بالنسبة للتصوير الفلوري بالأكسجين الأحادي ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت Hanks HEPES قبل إضافة 100 نانومتر Si-DMA في المخزن المؤقت Hanks HEPES (DOJINDO ، # MT05).بعد التعرض للضوء ، تم تحضين الخلايا في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.تم بعد ذلك غسل الخلايا مرتين باستخدام المخزن المؤقت HEPES الخاص بـ Hanks ومقاومة تلوثها باستخدام Hoechst في المخزن المؤقت HEPES الخاص بـ Hanks لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتصور باستخدام مجهر متحد البؤر ZEISS LSM 900.، # M36008) في المخزن المؤقت HBSS الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم.بعد التعرض للضوء أو دوكسوروبيسين (MCE ، # HY-15142A) ، تم تحضين الخلايا في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، وغسلها مرتين باستخدام محلول HBSS ، وحضنت مع Hoechst في HBSS في درجة حرارة الغرفة.الدقائق.تم استخدام Doxorubicin كعنصر تحكم إيجابي في المسبار حيث عولجت الخلايا بـ 20 ميكرومتر من دوكسوروبيسين في HBSS التي تحتوي على 1 ٪ BSA لمدة 30 دقيقة.تم الحصول على صور الفلورسنت المناعي باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 900.
تم زرع خلايا HEK293T التي تعبر بشكل ثابت عن mito-miniSOG بكثافة تقارب 30٪ في أطباق 15 سم.بعد 48 ساعة ، عندما تم الوصول إلى التقاء 80 ٪ تقريبًا ، تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، واحتضانها بمسبار 1 ملي مولار 3 في محلول HBSS طازج لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ثم تضيء بمصباح LED أزرق لمدة 10 دقائق في الغرفة درجة الحرارة..بعد ذلك ، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني ، وكشطها وتعليقها في محلول PBS بارد مثلج يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني الخالية من EDTA (MCE ، # HY-K0011).تم تفكيك الخلايا عن طريق صوتنة الطرف لمدة دقيقة واحدة (ثانية واحدة و 1 ثانية بسعة 35 ٪).تم الطرد المركزي للخليط الناتج عند 15871 x جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام ، وتم تعديل تركيز المادة الطافية إلى 4 مجم / مل باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (Beyotime ، # P0009).اجمع بين 1 مل من المحللة أعلاه مع 0.1 مم من أزيد البيوتين القابل للتحلل الضوئي (Confluore ، # BBBD-14) ، و 1 مم TCEP (Sangon ، # A600974) ، و 0.1 ملي مولار من يجند TBTA (Aladdin ، # T162437) ، وحاضنة CuSO4 1 مم مع قاع تناوب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.بعد التفاعل المفاجئ ، أضف الخليط إلى المحلول المخلوط مسبقًا (MeOH: CHCl3: H2O = 4 مل: 1 مل: 3 مل) في قنينة زجاجية سعة 10 مل.تم خلط العينات وطردها عند 4500 جم لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة.تم التخلص من المحاليل العلوية والسفلية ، وغسل الراسب مرتين باستخدام 1 مل من الميثانول وطرده عند 15871 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.أضف 1 مل من 8 م يوريا (علاء الدين ، رقم U111902) في 25 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم (ABC ، ​​علاء الدين ، رقم A110539) لإذابة الراسب.أعيد تكوين العينات باستخدام 10 ملي ديثيوثريتول (Sangon ، # A100281 في 25 ملي مولار ABC) لمدة 40 دقيقة عند 55 درجة مئوية متبوعة بإضافة 15 ملي مولار من أيودواسيتاميد طازج (Sangon ، # A600539) في درجة حرارة الغرفة في الظلام.الألكلة خلال 30 دقيقة..تمت إضافة 5 ملي ديثيوثريتول إضافية لوقف التفاعل.تحضير ما يقرب من 100 ميكرولتر من الخرز agarose NeutrAvidin (Thermo ، # 29202) لكل عينة عن طريق الغسيل 3 مرات مع 1 مل PBS.تم تخفيف محلول البروتين أعلاه بـ 5 مل من PBS واحتضانه بحبات أغروس NeutrAvidin التي تم غسلها مسبقًا لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة الغرفة.تم بعد ذلك غسل الحبيبات 3 مرات باستخدام 5 مل من PBS تحتوي على 0.2 ٪ SDS (Sangon ، # A600485) ، 3 مرات مع 5 مل من PBS تحتوي على 1 مليون يوريا ، و 3 مرات مع 5 مل ddH2O.ثم تم حصاد الخرزات عن طريق الطرد المركزي وتعليقها في 200 ميكرولتر من 25 ملي ABC تحتوي على 1 ميكرولتر من اليوريا ، 1 ملي كلوريد الكالسيوم 2 (Macklin ، # C805228) و 20 نانوغرام / ميكرولتر التربسين (Promega ، # V5280).التربسين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية بالتناوب.تم إيقاف التفاعل بإضافة حمض الفورميك (Thermo ، # A117-50) حتى وصل الرقم الهيدروجيني إلى 2-3.تم غسل الحبيبات 3 مرات باستخدام 1 مل من PBS الذي يحتوي على 0.2 ٪ SDS ، و 3 مرات مع 1 مل من PBS يحتوي على 1 M يوريا ، ثم 3 مرات باستخدام 1 مل من الماء المقطر.تم إطلاق الببتيدات المعدلة بواسطة تحلل خفيف (365 نانومتر) لمدة 90 دقيقة باستخدام 200 ميكرولتر من 70 ٪ MeOH.بعد الطرد المركزي ، تم جمع المادة الطافية.تم بعد ذلك غسل الحبيبات مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر من 70 ٪ MeOH وتم تجميع المواد الطافية.تم تجفيف العينات في مكثف فراغ Speedvac وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى التحليل.
لتحديد وقياس الببتيدات المعدلة بالأكسجين المفردة ، تم إعادة تذويب العينات في حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ وتم تحليل 1 ميكروغرام من الببتيدات باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Fusion Lumos Tribrid المجهز بمصدر ESI نانو من Tune و Xcalibur من برنامج البائع 4.3.تم فصل العينات على عمود شعري معبأ داخليًا 75 ميكرومتر × 15 سم مع 3 ميكرومتر من مادة C18 (ReproSil-pur ، # r13.b9.) وتم توصيلها بنظام EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).تم فصل الببتيدات بواسطة كروماتوجرافيا متدرجة خطية 95 دقيقة من 8٪ مذيب ب إلى 50٪ مذيب ب (أ = 0.1٪ حمض فورميك في الماء ، ب = 0.1٪ حمض فورميك في 80٪ أسيتونيتريل) ، ثم زاد خطيًا إلى 98٪ ب دقيقة في 6 دقائق بمعدل تدفق 300 نيوتن / دقيقة.يجمع Orbitrap Fusion Lumos البيانات بالتناوب بين مسح MS الكامل ومسح MS2 اعتمادًا على البيانات.تم ضبط جهد الرش على 2.1 كيلو فولت وكانت درجة حرارة الشعيرات الدموية لنقل الأيونات 320 درجة مئوية.تم جمع أطياف MS (350-2000 م / ض) بدقة 120.000 ، AGC 4 × 105 ، ووقت إدخال أقصى قدره 150 مللي ثانية.تم تجزئة السلائف العشر الأكثر شيوعًا في كل مسح كامل باستخدام HCD مع طاقة تصادم طبيعية بنسبة 30 ٪ ، ونافذة عزل رباعي الأقطاب تبلغ 1.6 م / ض ، وإعداد دقة 30000.هدف AGC لقياس الطيف الكتلي الترادفي باستخدام 5 × 104 ووقت الإدخال الأقصى 150 مللي ثانية.تم تعيين الاستثناء الديناميكي على 30 ثانية. تم رفض الأيونات غير المعينة أو تلك المشحونة بـ 1+ و> 7+ بالنسبة لـ MS / MS. تم رفض الأيونات غير المعينة أو تلك المشحونة بـ 1+ و> 7+ بالنسبة لـ MS / MS. еназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. تم رفض الأيونات أو الأيونات غير المعينة بتكلفة 1+ و> 7+ بالنسبة لـ MS / MS.未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 еуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. تم رفض أيونات أو أيونات غير محددة بتهمة 1+ و> 7+ بالنسبة لمرض التصلب العصبي المتعدد / مرض التصلب العصبي المتعدد.
تتم معالجة البيانات الأولية باستخدام منصة الحوسبة FragPipe القائمة على MSFragger.تم تحديد تحيزات الكتلة والأحماض الأمينية المقابلة باستخدام خوارزمية بحث مفتوح مع تحمل كتلة سلائف من -150 إلى 500 دا.تم بعد ذلك تحديد الببتيدات المعدلة باستخدام تعديلات الهيستيدين مع مكاسب جماعية +229.0964 و +247.1069 Da في PD (Proteome Discoverer 2.5 ، Thermo).
تم طلاء الخلايا التي تعبر بشكل ثابت عن جين miniSOG المندمج في أطباق بحجم 6 سم.عند الوصول إلى التقاء 80 ٪ تقريبًا ، تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام HBSS (Gibco ، # 14025092) ، ثم تم تحضينها بمجسات كيميائية في HBSS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية وإضاءةها بالضوء الأزرق.10W LED لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.لتحديد نوع أنواع الأكسجين التفاعلية المتضمنة في PDPL ، 0.5 ملي فيتامين ج (MCE ، # HY-B0166) ، 5 ملي مولار ترولوكس (MCE ، # HY-101445) ، D2O (سيغما ، # 7789-20-0) ، تمت إضافة 100 ملي مولار مانيتول (الطاقة الكيميائية ، # 69-65-8) ، 100 ميكرومتر H O ، 10 ملي مولار NaN3 إلى الخلايا كمكملات.بعد الغسل باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ، تم كشط الخلايا ، وجمعها في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وصوتها بطرف لمدة دقيقة واحدة في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع مثبط بروتياز 1x بدون EDTA (1 ثانية و 1 ثانية بدون سعة 35٪).تم طرد الخليط الناتج عند 15871 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتم تعديل تركيز المادة الطافية إلى 1 مجم / مل باستخدام مجموعة اختبار بروتين BCA.تم تحضين ما يقرب من 50 ميكرولتر من المحللة أعلاه باستخدام 0.1 ملي مولار من أزيد رودامين (علاء الدين ، رقم T131368) ، 1 ملي مولار TCEP ، 0.1 ملي مولار من يجند TBTA ، و 1 ملي مولار من CuSO4 لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة مع الدوران من الأسفل إلى الأعلى.بعد تفاعل النقر ، تم إجراء الترسيب باستخدام الأسيتون عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من الأسيتون المبرد مسبقًا إلى العينات ، واحتضانها عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة والطرد المركزي عند 6010 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.جمع بيليه ويغلي في 50 ميكرولتر من العازلة 1x Laemmli لمدة 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية.ثم تم تحليل العينات على المواد الهلامية الطويلة SDS-PAGE وتم تصورها باستخدام نظام التصوير Bio-rad ChemiDoc MP Touch مع برنامج Image Lab Touch.
تم إجراء تعبير وتنقية بروتين miniSOG-6xHis المؤتلف كما هو موضح سابقًا.باختصار ، تم تحويل خلايا E. coli BL21 (DE3) (TransGen ، # CD701-02) باستخدام pET21a-miniSOG-6xH وتم إحداث تعبير البروتين باستخدام 0.5 ملي مولار IPTG (Sangon ، # A600168).بعد تحلل الخلية ، تمت تنقية البروتينات باستخدام حبيبات agarose Ni-NTA (MCE ، رقم 70666) ، وتم تحليلها ضد PBS ، وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
لمقايسة القرب من ملصق المختبر المعتمد على الجسم المضاد ، قم بخلط 100 ميكرومتر من miniSOG المنقى ، ومسبار 1 ملي 3 ، و 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة للفأر (TransGen ، # HT501-01) في برنامج تلفزيوني إلى حجم رد فعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر..تم تشعيع خليط التفاعل بضوء LED أزرق لمدة 0 ، 2 ، 5 ، 10 ، و 20 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.تم تحضين الخليط باستخدام 0.1 ملي مولار من البيوتين- PEG3- أزيد (Aladdin ، # B122225) ، 1 ملي مولار TCEP ، 0.1 ملي مولار من ليجند TBTA ، و 1 ملي مولار من CuSO4 لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة على هزاز حركة تصاعدية.بعد التفاعل المفاجئ ، أضف 4x Laemmli العازلة مباشرة إلى الخليط وتغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.تم تحليل العينات على المواد الهلامية SDS-PAGE وتحليلها بواسطة النشاف الغربي باستخدام الستربتافيدين- HRP (1: 1000 ، Solarbio ، # SE068).
تم استخدام الببتيد الاصطناعي المحتوي على الهيستيدين مع التوسط الطرفي C (LHDALDAK-CONH2) لتحليل وضع العلامات في المختبر على أساس الببتيد القريب.في هذا الاختبار ، تم خلط 100 ميكرومتر من miniSOG المنقى ، و 10 ملي مولار 3 و 2 ميكروغرام / مل من الببتيد الاصطناعي في برنامج تلفزيوني بحجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر.تم تشعيع خليط التفاعل بضوء LED أزرق لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة.تم تحليل ميكروليتر واحد من العينة باستخدام نظام LC-MS (Waters ، مطياف الكتلة SYNAPT XS Ions Mobility وقت الرحلة مع برنامج تحليل الطيف MassLynx).
تم زرع خلايا HEK293T التي تعبر بشكل ثابت عن جين اندماج miniSOG في أطباق 10 سم لخطوط ذات توطين عضيات مختلفة (Mito و ER و Nucleus) وأطباق 15 سم لخطوط Parkin-miniSOG و BRD4-miniSOG.عند الوصول إلى التقاء 90 ٪ تقريبًا ، تم غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام HBSS ، ثم تم تحضينها بالمسبار 3 في HBSS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية وإضاءتها بمصباح LED أزرق 10 وات في درجة حرارة الغرفة.من أجل وضع العلامات غير المتصل بـ Parkin ، تمت إضافة 10 ميكرومتر بروتون كربونيل سيانيد الناقل m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio ، # C6700) مع المسبار 3 في HBSS لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.كانت خطوات تحلل الخلية وكيمياء النقر والاختزال والألكلة هي نفسها كما هو موضح أعلاه ، باستثناء أنه تمت إضافة 2 مجم من محلول وتم استخدام biotin PEG3 azide في تفاعل النقر بدلاً من أزيد البيوتين القابل للتحلل الضوئي.بعد التخصيب ، تم غسل الحبيبات 3 مرات باستخدام 5 مل من PBS التي تحتوي على 0.2 ٪ SDS ، و 3 مرات مع 5 مل من PBS تحتوي على 1 M يوريا ، و 3 مرات مع 5 مل من PBS.بعد ذلك ، تمت إضافة 2 ميكروغرام من التربسين إلى 300 ميكرولتر 25 ملي مولار ABC تحتوي على 1 ميكرولتر من اليوريا لتقطيع البروتين طوال الليل عند 37 درجة مئوية.تم إيقاف التفاعل بإضافة حمض الفورميك حتى يتم الوصول إلى الرقم الهيدروجيني 2-3.بعد التربسين على الخرز ، تم تحلية محلول الببتيد باستخدام عمود SOLAµ HRP (Thermo ، # 60209-001) وتجفيفه في مكثف فراغ Speedvac.تمت إعادة إذابة الببتيدات في 0.1٪ حمض الفورميك و 500 نانوغرام من الببتيدات تم تحليلها باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap Fusion Lumos Tribrid المجهز بمصدر nano-ESI الموصوف أعلاه.تم فصل الببتيدات على أعمدة RP-HPLC التجارية (75 ميكرومتر × 2 سم) (Thermo ، رقم 164946) وأعمدة RP-HPLC التحليلية (75 ميكرومتر × 25 سم) (Thermo ، رقم 164941) ، وكلاهما مملوء بـ 2 ميكرومتر.التدرج من 8٪ إلى 35٪ ACN في 60 دقيقة ، ثم زاد خطيًا إلى 98٪ B في 6 دقائق بمعدل تدفق 300 Nl / min.تم جمع أطياف MS (350-1500 م / ض) بدقة 60.000 ، AGC 4 × 105 ، ووقت إدخال أقصى قدره 50 مللي ثانية.تم تجزئة الأيونات المختارة بالتسلسل بواسطة HCD في دورات 3 ثوانٍ مع طاقة تصادم طبيعية بنسبة 30٪ ، ونافذة عزل رباعية الأقطاب تبلغ 1.6 م / ض ، ودقة تبلغ 15000. هدف AGC مطياف الكتلة 5 × 104 ترادفي وأقصى وقت للحقن تم استخدام 22 مللي ثانية.تم ضبط الاستبعاد الديناميكي على 45 ثانية. تم رفض الأيونات غير المعينة أو تلك المشحونة بـ 1+ و> 7+ بالنسبة لـ MS / MS. تم رفض الأيونات غير المعينة أو تلك المشحونة بـ 1+ و> 7+ بالنسبة لـ MS / MS. еназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. تم رفض الأيونات أو الأيونات غير المعينة بتكلفة 1+ و> 7+ بالنسبة لـ MS / MS.未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。未 指定 的 离子 或 电荷 为 1+ 和> 7+ 的 离子 被 拒绝 用于 MS / MS。 еуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и> 7+ были отклонены для МС / МС. تم رفض أيونات أو أيونات غير محددة بتهمة 1+ و> 7+ بالنسبة لمرض التصلب العصبي المتعدد / مرض التصلب العصبي المتعدد.
كانت خطوات تحضير العينة حتى إثراء حبات NeutrAvidin هي نفسها كما في تحليل LC-MS / MS الموضح أعلاه.تم استخدام ما يقرب من 50 ميكروغرام من المحللة كمدخلات للتحكم في التحميل واستخدم 2 ملغ من المحللة لتفاعلات النقر.بعد التخصيب والغسيل بالنيوترافيدين ، تمت تصفية البروتينات المرتبطة بإضافة 50 ميكرولتر من محلول Laemmli إلى حبيبات راتنج agarose والغليان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.تم تحليل مدخلات حمل التحكم والعينات المخصبة بالخرز بواسطة SDS-PAGE وتم نقلها إلى أغشية PVDF (Millipore ، # ISEQ00010) بواسطة طرق لطخة غربية قياسية.تم حظر الأغشية باستخدام 5٪ لبن منزوع الدسم (Sangon ، # A600669) في TBS التي تحتوي على 0.1٪ توين -20 (TBST) واحتضانها بالتتابع مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية.تم تخفيف الأجسام المضادة الأولية بنسبة 1: 1000 في 5٪ لبن منزوع الدسم في TBST وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.تم استخدام الأجسام المضادة الثانوية بنسبة 1: 5000 وحضنت لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.تم تصور الأغشية بواسطة التلألؤ الكيميائي باستخدام نظام التصوير Chemidoc MP.يتم تقديم جميع عمليات المسح غير المقطوعة للبقع والمواد الهلامية في الشكل كبيانات أولية.
تضمنت الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ SFPQ للأرنب (CST ، رقم 71992) ، والأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لـ FUS (CST ، رقم 67840) ، والأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة لـ NSUN2 للأرنب (Proteintech ، رقم 20854-1- AP) ، جسم مضاد متعدد النسيلة مضاد لـ mSin3A للأرنب (Abcam ، # ab3479) ، جسم مضاد وحيد النسيلة مضاد للفأر (TransGen ، # HT201-02) ، جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر (TransGen ، # HC201-01) ، مضاد للأرانب -جسم مضاد أحادي النسيلة CDK2 (ABclonal ، # A0094) ، جسم مضاد أحادي النسيلة للأرنب لـ CTBP1 (ABclonal ، # A11600) ، جسم مضاد متعدد النسيلة للأرنب لـ DUT (ABclonal ، # A2901) ، جسم مضاد متعدد النسيلة للأرنب لـ PSMC4 (ABclonal) ، # A250 الأجسام المضادة DNAJB1 متعددة النسيلة (ABclonal ، # A5504).تم استخدام هذه الأجسام المضادة بتخفيف 1: 1000 في 5٪ لبن منزوع الدسم في TBST.تضمنت الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة مضاد IgG للأرنب (TransGen ، # HS101-01) ، مضاد IgG للفأر (TransGen ، # HS201-01) بتخفيف 1: 5000.
لمزيد من التحقيق فيما إذا كان BRD4 يتفاعل مع SFPQ ، تم طلاء خلايا HEK293T و BRD4-miniSOG المستقرة التي تعبر عن HEK293T في أطباق 10 سم.تم غسل الخلايا باستخدام PBS بارد ومحلول في محلول بيرس IP لتحلل 1 مل (Thermo Fisher ، # 87787) مع مثبط البروتياز الخالي من EDTA لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.بعد ذلك ، تم جمع المحللات في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل وطردها عند 15871 x ج لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.تم حصاد المادة الطافية واحتضانها بـ 5 ميكروغرام من الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المسمى بـ V5 (CST ، # 80076) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.اغسل ما يقرب من 50 ميكرولتر من حبات البروتين A / G المغناطيسية (MCE ، # HY-K0202) مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5٪ توين -20.ثم تم تحضين محللات الخلية بخرز مغناطيسي لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية مع الدوران من الأسفل إلى الأعلى.ثم تم غسل الحبات أربع مرات باستخدام 1 مل من محلول PBST وغليها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.تم تحليل العينات على المواد الهلامية SDS-PAGE ونقلها إلى أغشية PVDF باستخدام طرق اللطخة الغربية القياسية.تم حظر الأغشية في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في TBST وحُضنت بالتتابع باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية.تم استخدام الجسم المضاد الأساسي للأرنب المضاد أحادي النسيلة (CST ، # 71992) بنسبة 1: 1000 في 5 ٪ من الحليب منزوع الدسم في TBST وحضنت طوال الليل عند 4 درجات مئوية.تم استخدام IgG المضاد للأرنب بنسبة 1: 5000 وحضنت لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.تم تصور الأغشية بواسطة التلألؤ الكيميائي باستخدام نظام التصوير Chemidoc MP.
تم الحصول على جميع الهياكل المستخدمة لتحليل منطقة سطح المذيبات التي يمكن الوصول إليها (SASA) من بنك بيانات البروتين (PDB) 52 أو قاعدة بيانات بنية البروتين AlphaFold.تم حساب Absolute SASA لكل بقايا باستخدام برنامج FreeSASA.تم استخدام بيانات SASA الكاملة وغير الغامضة فقط للحامض الهيستيدين المسمى وجيرانه للحصول على متوسط ​​SASA لكل بنية.تم حساب إمكانية الوصول إلى المذيب النسبية (RSA) لكل هيستيدين عن طريق قسمة قيمة SASA المطلقة على مساحة سطح البقايا القصوى التجريبية المتاحة للمذيب.تم تصنيف جميع الهيستيدات بعد ذلك على أنها مخفية إذا كان متوسط ​​RSA أقل من 20 ٪ ، وإلا تم تعريضه.
تم البحث في الملفات الأولية التي تم الحصول عليها في وضع DDA باستخدام Proteome Discoverer (v2.5) أو MSfragger (Fragpipe v15.0) في قاعدة بيانات البروتين المناسبة التي تم التحقق منها من SwissProt والتي تحتوي على ملوثات شائعة.تتطلب الببتيدات التربسين الكامل مع موقعي انقسام مفقودين ، مثيلة الكربامويل كتعديل ثابت وأكسدة الميثيونين كتعديل ديناميكي.تم ضبط التفاوتات في وزن السلائف والجزء على 10 جزء في المليون و 0.02 Da (MS2 Orbitrap) ، على التوالي. تمت إزالة الضربات الملوثة ، وتم ترشيح البروتينات للحصول على معدل اكتشاف خاطئ أقل من 1٪. تمت إزالة الضربات الملوثة ، وتم ترشيح البروتينات للحصول على معدل اكتشاف خاطئ أقل من 1٪. опадания загрязняющих веществ были удалены، а белки отфильтрованы، тобы получить коэффициерованы. تمت إزالة الضربات الملوثة وترشيح البروتينات لإعطاء معدل اكتشاف خاطئ أقل من 1٪.去除 污染物 命中 ， 过滤 蛋白质 以 获得 <1٪ 的 错误 发现 率。 <1٪ 的 错误 发现 率。 опадания загрязняющих веществ были удалены، абелки отфильтрованы для достижения уровня ложнаных 1٪. تمت إزالة الضربات الملوثة وترشيح البروتينات لتحقيق معدل إيجابي خاطئ أقل من 1٪.للتحليل الكمي بدون استخدام الملصقات ، تم استخدام محتوى البروتين الطبيعي من ثلاثة مكررات بيولوجية.تم إجراء تحليل التوطين الخلوي للبروتين باستخدام تحليل علم الوجود الجيني من DAVID Bioinformatics Resources و MitoCarta 3.0 وقواعد البيانات التي تم تجميعها ونشرها من قبل مجموعة Alice Ting.تم الحصول على خريطة البركان من Perseus (v1.6.15.0). تم اختبار تغييرات أضعاف وفرة البروتين من أجل الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار t على الوجهين ، وتم تحديد نتائج البروتين مع تغير الوفرة> 2 (ما لم يذكر خلاف ذلك) وقيمة p <0.05. تم اختبار تغييرات أضعاف وفرة البروتين من أجل الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار t على الوجهين ، وتم تحديد نتائج البروتين مع تغير الوفرة> 2 (ما لم يذكر خلاف ذلك) وقيمة p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. تم اختبار تغييرات أضعاف محتوى البروتين من أجل الأهمية الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الذيل ، وتم تحديد تطابق البروتين مع تغيير المحتوى> 2 (ما لم يُذكر خلاف ذلك) وقيمة ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰 度 倍数 变化 的 统计 显 着 性 ， 并 确定 蛋白质 的 的 丰 度 变化> 2 （除非 另有 说明） p 值 <0.05使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 的 统计 显 着 性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰 度 变化> 2 另 有 说明） 和 p 值 <0.05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. تم اختبار الدلالة الإحصائية لتغيرات الطيات في محتوى البروتين باستخدام اختبار t ثنائي الذيل ، وتم تحديد مطابقات البروتين لتغييرات المحتوى> 2 (ما لم يُذكر خلاف ذلك) والقيم p <0.05.تم إجراء تحليل تفاعل البروتين باستخدام تحليل GO جنبًا إلى جنب مع قاعدة بيانات String.
تم إجراء ثلاث مكررات بيولوجية مع نتائج مماثلة.تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام GraphPad Prism (برنامج GraphPad) وتم إنشاء مخططات البركان باستخدام Perseus (v1.6.15.0).لمقارنة المجموعتين ، تم تحديد قيم p باستخدام اختبار الطالب ثنائي الذيل.تم تضمين البروتينات المفردة فقط التي تم تحديدها مرتين على الأقل في المجموعة التجريبية في مخططات البركان ، وتم استبدال القيم المفقودة المقابلة في المجموعة الضابطة بـ Perseus من التوزيع الطبيعي بحيث يمكن حساب القيمة p.تمثل أشرطة الخطأ متوسط ​​± الانحراف المعياري.في التحليلات البروتينية للتحليل الإحصائي ، تم الاحتفاظ بوفرة البروتينات التي ظهرت في نسختين بيولوجيتين على الأقل.لم يتم استخدام الأساليب الإحصائية لتحديد حجم العينة مسبقًا.التجارب ليست عشوائية.لم يكن الباحثون أعمى عن المهام أثناء التجربة وتقييم النتائج.
لمزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة ، راجع ملخص تقرير Nature Research المرتبط بهذه المقالة.
تم تقديم بيانات قياس الطيف الكتلي التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة إلى اتحاد ProteomeXchange Consortium عبر مستودع شريك iProX57 تحت معرف مجموعة البيانات PXD034811 (مجموعة بيانات PDPL-MS).يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.توفر هذه المقالة البيانات الأصلية.
Gingras، AC، Abe، KT & Raught، B. التعرف على الجوار: استخدام biotinylation المعتمد على القرب لتمييز مجمعات البروتين وتخطيط العضيات. Gingras، AC، Abe، KT & Raught، B. التعرف على الجوار: استخدام biotinylation المعتمد على القرب لتمييز مجمعات البروتين وتخطيط العضيات.Gingras و AS و Abe و KT و Raut و B. الإلمام بالمناطق المحيطة: استخدام biotinylation المعتمد على القرب لتمييز مجمعات البروتين وتخطيط العضيات. Gingras ، AC ، Abe ، KT & Raught ، B. 了解 邻里 ： 使用 邻近 依赖性 生物 素 化 来 表征 蛋白质 复合 物 并 绘制 细胞 器 图。 Gingras، AC، Abe، KT & Raught، B. فهم الجوار: استخدم اعتماد الحي على الحياة البيولوجية.Gingras، AS، Abe، KT and Raut، B. فهم القرب: توصيف مجمعات البروتين ورسم خرائط للعضيات باستخدام biotinylation المعتمد على القرب.تيار.رأيي.المواد الكيميائية.علم الأحياء 48 ، 44-54 (2019).
جيري ، جي بي وآخرون.رسم خرائط البيئة الدقيقة عن طريق نقل طاقة دكستر إلى الخلايا المناعية.العلوم 367 ، 1091-1097 (2020).
هيرتلنج ، إي إل وآخرون.تكتشف شبكات النطاق ثنائية البروتين إعادة التشكيل الخاصة بالخلية للتفاعل البشري.الخلايا 184 ، 3022-3040 ، 3028 (2021).