أخبار

تتطلب استراتيجيات التشخيص التقليدية للكشف عن الأمراض المعدية استخدام أدوات منضدية غير مناسبة لاختبار نقطة الرعاية (POCT).الموائع الدقيقة الناشئة هي تقنية مصغرة للغاية ومؤتمتة ومتكاملة تعد بديلاً محتملاً للطرق التقليدية للتشخيص السريع والمنخفض التكلفة والدقيق في الموقع.تُستخدم طرق التشخيص الجزيئي على نطاق واسع في أجهزة ميكروفلويديك باعتبارها أكثر الطرق فعالية لاكتشاف العوامل الممرضة.تلخص هذه المراجعة التطورات الحديثة في التشخيص الجزيئي القائم على الموائع الدقيقة للأمراض المعدية من منظور أكاديمي وصناعي.أولاً ، نصف معالجة نموذجية للأحماض النووية على الرقاقة ، بما في ذلك المعالجة المسبقة للعينات ، والتضخيم ، وقراءة الإشارة.ثم تتم مقارنة خصائص ومزايا وعيوب الأنواع الأربعة لمنصات موائع جزيئية.بعد ذلك ، سنناقش استخدام المقايسات الرقمية للتقدير الكمي المطلق للأحماض النووية.يتم تلخيص كل من أجهزة التشخيص الجزيئي التجارية التقليدية والحديثة القائمة على موائع جزيئية كدليل على الحالة الحالية للسوق.أخيرًا ، نقترح الاتجاهات المستقبلية لتشخيص الموائع الدقيقة للأمراض المعدية.
تسبب الأمراض المعدية مسببات الأمراض ، بما في ذلك البكتيريا والفيروسات والطفيليات المنتشرة في جميع أنحاء العالم.على عكس الأمراض الأخرى ، سرعان ما تصاب مسببات الأمراض بالعدوى وتنتشر بين البشر والحيوانات المضيفة من خلال التلقيح ووسائط الهواء والماء [1].الوقاية من الأمراض المعدية أمر بالغ الأهمية كتدبير من تدابير الصحة العامة.ثلاث استراتيجيات رئيسية لمكافحة الأمراض المعدية: (1) السيطرة على مصدر العدوى.(2) انقطاع مسار الإرسال ؛(3) حماية السكان المعرضين للإصابة.من بين الاستراتيجيات الرئيسية ، تعتبر السيطرة على مصدر العدوى من أهم الإستراتيجيات بسبب ملاءمتها وقلة تكلفتها.يعد التشخيص السريع والعزل والعلاج للأفراد المصابين أمرًا بالغ الأهمية ، ويتطلب استراتيجيات تشخيص سريعة وحساسة ودقيقة [2].عادةً ما يجمع التشخيص الحالي للأمراض المعدية بين الفحص السريري بناءً على العلامات والأعراض والدراسات المعملية مثل زراعة الخلايا والتشخيص الجزيئي ، والتي تتطلب موظفين مدربين وإجراءات كثيفة العمالة ومعدات اختبار باهظة الثمن [3 ، 4].تتطلب الوقاية من تفشي الأمراض المعدية تشخيصًا محليًا سريعًا وغير مكلف ودقيق ، خاصة في المناطق محدودة الموارد حيث تكون الأمراض المعدية شائعة وخطيرة [5] ، بالإضافة إلى العلاج في البرية أو في ساحة المعركة ، حيث لا يمكن التنبؤ بحالات الطوارئ..الرعاية الطبية محدودة [6].في هذا السياق ، تعتبر الموائع الدقيقة تقنية تجمع بين تقنيات الأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة ، أو تقنية النانو ، أو علم المواد من أجل معالجة دقيقة للسوائل [7،8،9،10] ، مما يوفر إمكانيات جديدة لاكتشاف نقطة الرعاية (POCT).) العوامل المعدية خارج المستشفيات والمختبرات.مقارنةً بالتشخيصات التقليدية التي تستغرق وقتًا طويلاً ، فإن تقنية الموائع الدقيقة توفر عينات وتكاليف للتشخيص الجزيئي أثناء تفشي المرض.إن الانتشار العالمي لمرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ناجم عن متلازمة الالتهاب التنفسي الحاد الوخيم التاجي 2 (SARS-CoV-2) ، لذلك تم التأكيد مرة أخرى على أهمية الموائع الدقيقة للوقاية من الجائحة ومكافحتها في الوقت المناسب [11 ، 12 ، 13].على عكس التشخيصات التقليدية ، تستخدم الاختبارات في نقطة الرعاية الموائع الدقيقة أجهزة محمولة صغيرة تتراوح من أجهزة التحليل الموضوعة على الطاولة إلى شرائط اختبار التيار الجانبي الصغيرة للاختبار بالقرب من نقطة أخذ العينات [14].تتميز هذه الاختبارات بتبسيط أو عدم تحضير العينة ، وتضخيم سريع للإشارة ، وقراءات إشارة حساسة تؤدي إلى مدة قصيرة ونتائج دقيقة في غضون دقائق.أدى توفر أدوات الرعاية الصحية القائمة على الموائع الدقيقة والإنتاج الضخم لها إلى توسيع نطاق تطبيقاتها التشخيصية المباشرة والفعالة من حيث التكلفة خارج المستشفى وبالقرب من المريض وحتى في المنزل.
من بين الاستراتيجيات الموجودة لتشخيص الأمراض المعدية ، يعتبر التشخيص الجزيئي من أكثر الاستراتيجيات حساسية [15 ، 16].بالإضافة إلى ذلك ، غالبًا ما يتم استخدام التشخيص الجزيئي كمعيار ذهبي للكشف المستمر عن COVID-19 ، مما يسمح بالكشف المباشر عن المناطق الخاصة بالفيروس من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي قبل بدء الاستجابة المناعية [17 ، 18].في المراجعة الحالية ، نقدم أحدث التطورات في عمليات التشخيص الجزيئي القائمة على الموائع الدقيقة للأمراض المعدية ، من منظور أكاديمي إلى وجهات نظر صناعية مستقبلية (الشكل 1).سنبدأ بثلاث خطوات رئيسية في اكتشاف الحمض النووي: المعالجة المسبقة للعينة على الرقاقة ، وتضخيم الحمض النووي ، وقراءة الإشارة.ثم قمنا بمقارنة أنواع مختلفة من منصات ميكروفلويديك مع هيكلها ووظيفتها ، مع إظهار خصائص فريدة (نقاط القوة والضعف).تمت مناقشة الكشف عن الحمض النووي الرقمي بشكل أكبر وإعطاؤه كمثال لتقنية الجيل الثالث للتقدير الكمي المطلق لجزيئات مسببات الأمراض المعدية.بالإضافة إلى ذلك ، سيتم تقديم العديد من أجهزة الاختبارات في نقطة الرعاية النموذجية وأحدث الأجهزة التجارية لإثبات الحالة الحالية لسوق الموائع الدقيقة في الاختبارات في نقطة الرعاية للتشخيص الجزيئي.سنناقش أيضًا ونوضح رؤيتنا للتطبيقات المستقبلية.
يمكن تقسيم وحدات رقائق الموائع الدقيقة للكشف عن الحمض النووي إلى ثلاث فئات (أخذ العينات ، والتعرف ، والتشوير) وفقًا لوظائفها [19].من بين هذه الوحدات ، تدرك وحدة أخذ العينات بشكل أساسي تحلل العينة واستخراج الحمض النووي.تتحكم وحدة المستشعر بشكل أساسي في تحويل وتضخيم إشارات الحمض النووي.تكتشف وحدة الإشارة الإشارة المحولة والمعالجة بواسطة وحدة الاستشعار.استنادًا إلى عملية الكشف عن الأحماض النووية على شريحة ، سنلخص الشرائح المختلفة التي يمكنها تحقيق وظيفة "الإدخال والإخراج".
الخطوة الأولى في اكتشاف الحمض النووي هي استخراج الحمض النووي ، أي عزل الحمض النووي المستهدف من العينة الأصلية.يتم إجراء استخراج الحمض النووي لتنقية الأحماض النووية من الملوثات الجزيئية الأخرى ، وضمان سلامة التركيب الأساسي لجزيئات الحمض النووي ، وتحسين النتائج.يتطلب استخلاص الحمض النووي تحلل العينة الضروري والتقاط الحمض النووي ، والتي تؤثر جودتها وكفاءتها بشكل كبير على نتائج البحث والتشخيص.قد تؤدي أي آثار جانبية طفيفة أثناء الاستخراج إلى الحد من الكشف الإضافي.على سبيل المثال ، يتم تثبيط طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والتضخيم المتساوي للحرارة الحلقي (LAMP) بواسطة بعض المذيبات العضوية المتبقية مثل الإيثانول والأيزوبروبانول في كواشف عزل الحمض النووي [20].يعتبر الاستخلاص السائل والسائل واستخلاص الطور الصلب من أكثر الطرق شيوعًا لعزل الأحماض النووية [21] ، ومع ذلك ، فإن الاستخلاص السائل والسائل على شريحة محدودة للغاية ، نظرًا لأن الكواشف المستخدمة في استخلاص السائل والسائل تسبب تآكل معظم رقائق الموائع الدقيقة .هنا ، نسلط الضوء على طرق استخراج المرحلة الصلبة القائمة على ميكروأري ونقارن مزاياها وعيوبها.
السيليكون مادة ركيزة متوافقة مع الأحماض النووية نظرًا لتوافقها الحيوي واستقرارها وسهولة تعديلها [22].الأهم من ذلك ، عند تعديله بالسيليكا أو مواد أخرى ، يُظهر هذا المركب خصائص تمتص الأحماض النووية سالبة الشحنة تحت درجة حموضة منخفضة ، وظروف ملح عالية أثناء التصفية باستخدام درجة حموضة عالية ، ومحاليل ملح منخفضة.بناءً على هذه الظاهرة ، من الممكن تنقية الحمض النووي.
تم استخدام أشكال مختلفة من المواد القائمة على السيليكا لاستخراج الحمض النووي في الموائع الدقيقة ، مثل حبيبات السيليكا والمساحيق ومرشحات الألياف الدقيقة وأغشية السيليكا [23 ، 24 ، 25 ، 26].اعتمادًا على خصائص المادة ، يمكن استخدام المواد القائمة على السيليكون في الدوائر الدقيقة بطرق مختلفة.على سبيل المثال ، يمكن ببساطة وضع حبيبات السيليكا والمساحيق والمرشحات النانوية التجارية في المسام أو القنوات الدقيقة لرقائق الموائع الدقيقة والمساعدة في استخراج الأحماض النووية من العينات [27 ، 28 ، 29].يمكن أيضًا استخدام أغشية السيليكا المعدلة على السطح لتنقية الحمض النووي بسرعة من مسببات الأمراض بتكلفة منخفضة.على سبيل المثال ، Wang et al.[30] من خلال الجمع بين تفاعلات تضخيم تغيير طبيعة مع تبادل سلسلة بوساطة الحويصلة مع أغشية السيليكا المطلية بسكريات قليلة الشيتوزان ، تم تقديم نظام محمول متعدد الاستخدامات اكتشف بنجاح 102-108 وحدة تشكيل مستعمرة.(CFU) / مل Vibrio parahaemolyticus.وكان وجود الفيروس مرئيًا بسهولة.باول وآخرون.[31] ثم تم استخدام المصفوفات الدقيقة القائمة على السيليكون للكشف عن فيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) ، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، وفيروس زيكا ، وفيروس الورم الحليمي البشري والتكاثر التلقائي ، حيث تم تطوير مفاعل دقيق ملتوي 1.3 ميكرولتر لالتقاط فيروسات الحمض النووي الريبي.وإجراء التضخيم في الموقع.بالإضافة إلى هذه الطرق ، تلعب أعمدة السليكا الدقيقة المعدلة على السطح أيضًا دورًا رئيسيًا في استخراج الحمض النووي ، حيث تزيد هندسة وخصائص المادة المعدلة بشكل كبير من كفاءة الاستخراج.Chen et al.[32] اقترح منصة ميكروفلويديك لعزل الحمض النووي الريبي منخفض التركيز على أساس أعمدة السيليكون المغلفة بالأمينو.يدمج جهاز الموائع الدقيقة هذا مصفوفة من المسامير الدقيقة 0.25 سم 2 على ركيزة من السيليكون لتحقيق كفاءة استخلاص أعلى من خلال مساحة سطح عالية لتصميم نسبة الحجم.تتمثل ميزة هذا التصميم في أن جهاز الموائع الدقيقة يمكنه تحقيق ما يصل إلى 95٪ من كفاءة استخراج الحمض النووي.توضح هذه الاستراتيجيات القائمة على السيليكون قيمة عزل الأحماض النووية بسرعة بتكلفة منخفضة.بالاشتراك مع رقائق الموائع الدقيقة ، لا يمكن لاستراتيجيات الاستخراج المعتمدة على السيليكون أن تزيد من كفاءة اكتشاف الحمض النووي فحسب ، بل تسهل أيضًا تصغير وتكامل الأجهزة التحليلية [20].
تستخدم طرق الفصل المغناطيسي الجسيمات المغناطيسية لعزل الأحماض النووية في وجود مجال مغناطيسي خارجي.تشتمل الجسيمات المغناطيسية الشائعة الاستخدام على جسيمات مغناطيسية Fe3O4 أو γ-Fe2O3 مغلفة بالسيليكا والأمينو والكربوكسيل [33،34،35،36].السمة المميزة للجسيمات المغناطيسية مقارنة بأساليب SPE القائمة على السيليكون هي سهولة التلاعب والتحكم بالمغناطيسات الخارجية.
باستخدام التفاعل الكهروستاتيكي بين الأحماض النووية والسيليكا ، في ظل ظروف ارتفاع الملح وانخفاض درجة الحموضة ، يتم امتصاص الأحماض النووية على سطح الجزيئات المغناطيسية المغلفة بالسيليكا ، بينما في ظل ظروف انخفاض الملح وارتفاع درجة الحموضة ، يمكن غسل الجزيئات تكرارا..تتيح الخرزات المغناطيسية المطلية بالسيليكا استخلاص الحمض النووي من عينات كبيرة الحجم (400 ميكرولتر) باستخدام حركة يتم التحكم فيها مغناطيسيًا [37].كتوضيح ، رودريغيز ماتيوس وآخرون.[38] تستخدم مغناطيسات قابلة للضبط للتحكم في نقل الحبيبات المغناطيسية إلى غرف مختلفة.استنادًا إلى الجزيئات المغناطيسية المغلفة بالسيليكا ، يمكن استخراج 470 نسخة / مل من الحمض النووي الريبي الجيني SARS-CoV-2 من عينات مياه الصرف للكشف عن النسخ العكسي لمصباح (RT-LAMP) ويمكن قراءة الاستجابة في غضون ساعة واحدة.بالعين المجردة (الشكل 2 أ).
أجهزة تعتمد على مواد مغناطيسية ومسامية.رسم تخطيطي مفاهيمي لجهاز IFAST RT-LAMP ميكروفلويديك للكشف عن SARS-CoV-2 RNA (مقتبس من [38]).ب الجهاز الدقيق للطرد المركزي لـ dSPE للحامض النووي المسحة الشدقية (مقتبس من [39]).ج مُكثِّف عينة مدمج يعمل بالطاقة الذاتية باستخدام بطاقة FTA® (مقتبس من [50]).د ورق ترشيح Fusion 5 معدّل بالكيتوزان (مقتبس من [51]).SARS-CoV-2 المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة فيروس كورونا 2 ، حلقة النسخ العكسي RT-LAMP بوساطة تضخيم متساوي الحرارة ، شركاء تكنولوجيا مكتشفات اتفاقية التجارة الحرة ، حمض نووي NA
الجسيمات المغناطيسية موجبة الشحنة مثالية لربط العمود الفقري للفوسفات في الحمض النووي.عند تركيز ملح معين ، يمكن أن تكون مجموعات الفوسفات سالبة الشحنة من الأحماض النووية مشحونة إيجابياً على سطح الجزيئات المركبة المغناطيسية.لذلك ، تم تطوير الجسيمات النانوية المغناطيسية ذات السطح الخشن والكثافة العالية للمجموعات الأمينية لاستخراج الأحماض النووية.بعد الفصل المغناطيسي والحجب ، يمكن استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية ومجمعات الحمض النووي بشكل مباشر في تفاعل البوليميراز المتسلسل ، مما يلغي الحاجة إلى عمليات التنقية والشطف المعقدة والمستهلكة للوقت [35].كما تم استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية المغلفة بمجموعات كربوكسيل سلبية لفصل الأحماض النووية الممتصة على الأسطح في محاليل بولي إيثيلين جلايكول عالية التركيز ومحلول كلوريد الصوديوم [36].باستخدام هذه الخرزات المغناطيسية المعدلة على السطح ، يكون استخراج الحمض النووي متوافقًا مع التضخيم اللاحق.Dignan et al.[39] وصفت منصة آلية ومحمولة للطرد المركزي للموائع الدقيقة للمعالجة المسبقة للحمض النووي ، مما يسمح للأفراد غير التقنيين باستخدامها في الموقع.بالإضافة إلى ذلك ، فإن توافق الحمض النووي المعزول مع LAMP ، وهي طريقة مناسبة تمامًا لتحليل الحمض النووي في نقطة الرعاية ، يوضح أيضًا الحد الأدنى من متطلبات المعدات ومدى ملاءمتها للمقايسات اللونية (الشكل 2 ب).
توفر طرق الخرزة المغناطيسية إمكانية الاستخراج الآلي ، والتي يوجد بعضها في مستخلصات الحمض النووي المؤتمتة التجارية [KingFisher؛ThermoFisher (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، QIAcube® HT ؛CapitalBio (بكين ، الصين) و Biomek® ؛بيكمان (ميامي ، الولايات المتحدة الأمريكية).) ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية)].يمكن استخدام مزايا الجمع بين الحبيبات المغناطيسية والموائع الدقيقة من أجل الاستخراج الآلي الفعال للأحماض النووية ، والتي يمكن أن تعزز تطوير التشخيص الجزيئي ؛ومع ذلك ، لا يزال الجمع بين الحبيبات المغناطيسية والموائع الدقيقة يعتمد بشكل كبير على أنظمة التحكم المعقدة للتلاعب الدقيق بالخرز المغناطيسي ، وهو ما يفسر شعبية المنتجات التجارية كونها ضخمة ومكلفة ، مما يحد من التطبيق الإضافي للخرز المغناطيسي في نقطة الرعاية.
كما تم استخدام العديد من المواد المسامية مثل مرشحات النيتروسليلوز المعدلة ، وبطاقات Finders Technology Associates (FTA) ، وأوراق الترشيح القائمة على البولي إيثر سلفون ، والمواد المطلية بالجليكان للكشف عن الحمض النووي [40 ، 41 ، 42 ، 43 ، 44].تم استخدام المواد الليفية المسامية مثل الورق الليفي لأول مرة لعزل الحمض النووي عن طريق التشابك الجسدي لجزيئات الحمض النووي طويلة الجديلة بالألياف.تؤدي المسام الصغيرة إلى تقييد مادي قوي لجزيئات الحمض النووي ، مما يؤثر إيجابًا على استخراج الحمض النووي.نظرًا لاختلاف أحجام المسام للورق الليفي ، فإن كفاءة الاستخراج لا يمكن أن تلبي احتياجات تضخيم الحمض النووي [45 ، 46].بطاقة FTA هي ورقة ترشيح تجارية تُستخدم في مجال الطب الشرعي وتستخدم على نطاق واسع في مجالات أخرى من التشخيص الجزيئي.من خلال استخدام ورق ترشيح السليلوز المشبع بمواد كيميائية مختلفة لتحليل أغشية الخلايا في العينة ، يتم حماية الحمض النووي المنطلق من التدهور لمدة تصل إلى عامين.في الآونة الأخيرة ، تم تطوير ورق السليلوز المشرب للكشف الجزيئي عن مسببات الأمراض المختلفة ، بما في ذلك SARS-CoV-2 وداء الليشمانيات والملاريا [47،48،49].يتم تحليل فيروس نقص المناعة البشرية في البلازما المعزولة مباشرة ، ويتم إثراء الحمض النووي الفيروسي في غشاء تدفق FTA® المدمج في المكثف ، مما يسمح بالإنتاج الفعال للحمض النووي [50] (الشكل 2 ج).المشكلة الرئيسية في اكتشاف الحمض النووي باستخدام بطاقات FTA هي أن المواد الكيميائية مثل Guanidine و isopropanol تمنع تفاعلات التضخيم اللاحقة.لحل هذه المشكلة ، قمنا بتطوير ورق الترشيح Fusion 5 المعدل بالشيتوزان ، والذي يجمع بين مزايا كل من التشابك الفيزيائي لجزيئات الحمض النووي وورق الترشيح الليفي ، والامتصاص الكهروستاتيكي للحمض النووي على المركبات المعدلة بالكيتوزان لتحقيق كفاءة عالية في استخراج الحمض النووي ..ألياف الترشيح [51] (الشكل 2 د).وبالمثل ، فإن Zhu et al.[52] أظهر طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المعدل بالكيتوزان على أساس نظام ميكروفلويديك الشعري في الموقع لعزل سريع واكتشاف الحمض النووي الريبي لفيروس زيكا.يمكن امتصاص / امتصاص الأحماض النووية في وسط محلول / PCR مختلط ، على التوالي ، بناءً على خاصية مفتاح التشغيل / الإيقاف في الشيتوزان.تشغيل وإيقاف "، يستجيب لدرجة الحموضة.
كما هو مذكور أعلاه ، تجمع هذه الاستراتيجيات بين مزايا مواد الطور الصلب المختلفة وتزيد من كفاءة استخراج الحمض النووي في الموائع الدقيقة.في التطبيقات العملية ، يعد استخدام هذه المواد بكميات كبيرة غير اقتصادي ، ويمكن أيضًا أن تحافظ المعالجة السطحية المناسبة أو تعديل السطح للمواد الشائعة مع هذه المواد على وظيفتها.لذلك ، يُعتقد أن تنفيذ هذه الاستراتيجيات بعد دراسة تجريبية يمكن أن يقلل التكاليف.
غالبًا ما يستخدم اختبار الحمض النووي على منصات ميكروفلويديك أحجام عينات صغيرة (أقل من 100 ميكرولتر) ، وبالتالي يتطلب تضخيم الأحماض النووية المستهدفة مع مجسات محددة للتحويل إلى إشارة ملائمة للكشف النهائي (بصري وكهربائي ومغناطيسي) [53 ، 54]. غالبًا ما يستخدم اختبار الحمض النووي على منصات ميكروفلويديك أحجام عينات صغيرة (أقل من 100 ميكرولتر) ، وبالتالي يتطلب تضخيم الأحماض النووية المستهدفة مع مجسات محددة للتحويل إلى إشارة ملائمة للكشف النهائي (بصري وكهربائي ومغناطيسي) [53 ، 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. عند اختبار الأحماض النووية على منصات ميكروفلويديك ، غالبًا ما يتم استخدام أحجام عينات صغيرة (<100 ميكرولتر) ، لذلك يلزم تضخيم الأحماض النووية المستهدفة باستخدام مجسات خاصة لتحويلها إلى إشارة ملائمة للكشف اللاحق (بصري وكهربائي ومغناطيسي) [53 ، 54].微 流 控 平台 上 的 核酸 检测 通常 使用 小 样本 量 （<100 l） ， 需要 使用 探针 扩增 目标 核酸 ， 以 便于 下游 检测 （光学 和 磁 学） 的 信号 [53، 54 ]。. ]。 Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. عادةً ما يستخدم الكشف عن الأحماض النووية على منصات ميكروفلويديك أحجام عينات صغيرة (أقل من 100 ميكرولتر) ، الأمر الذي يتطلب تضخيم الأحماض النووية المستهدفة باستخدام مجسات خاصة لتحويلها إلى إشارات للكشف اللاحق (بصري وكهربائي ومغناطيسي) [53 ، 54]] .يمكن أن يؤدي تضخيم الحمض النووي في الموائع الدقيقة إلى تسريع التفاعلات وتحسين حدود الكشف وتقليل متطلبات العينة وتحسين دقة الكشف [55 ، 56].في السنوات الأخيرة ، مع تحقيق الاكتشاف السريع والدقيق ، تم تطبيق طرق مختلفة لتضخيم الحمض النووي في الموائع الدقيقة ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل وبعض تفاعلات التضخيم متساوي الحرارة.سوف يلخص هذا القسم طرق الكشف عن الحمض النووي على أساس أنظمة ميكروفلويديك.
PCR هو محاكاة لعملية تكرار الحمض النووي للكائن الحي ، والتي تم وصف نظريتها بالتفصيل في مكان آخر ولن تتم مناقشتها هنا.يمكن لـ PCR تضخيم كمية صغيرة جدًا من DNA / RNA المستهدف بمعدل أسي ، مما يجعل PCR أداة قوية للكشف السريع عن الأحماض النووية.في العقود الأخيرة ، تم تطوير العديد من أجهزة ميكروفلويديك المحمولة المزودة بأنظمة التدوير الحراري PCR لتلبية احتياجات تشخيصات نقاط الرعاية [57 ، 58].يمكن تقسيم PCR على الرقاقة إلى أربعة أنواع (تقليدي ، تدفق مستمر ، تبديل مكاني ، و PCR الحمل الحراري) وفقًا لطرق التحكم في درجة الحرارة المختلفة [59].على سبيل المثال ، جي وآخرون.[60] طورت طريقة PCR الكمي للنسخ العكسي المباشر (RT-qPCR) على منصة الموائع الدقيقة الخاصة بهم للكشف المتعدد عن فيروسات SARS-CoV-2 والإنفلونزا A و B في عينات مسحة الحلق (الشكل 3 أ).بارك وآخرون.[61] قام ببناء شريحة بسيطة لتحليل العوامل الممرضة من خلال دمج PCR بغشاء رقيق ، وأقطاب كهربائية ، ووحدة ميكروفلويديك تعتمد على مادة البولي دايميثيل سيلوكسان التي تعمل بالإصبع.ومع ذلك ، يجسد كلا العملين أوجه القصور الشائعة في PCR التقليدي.يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل دورة حرارية ، مما يحد من مزيد من تصغير الجهاز ويقلل من وقت الاختبار.
يعد تطوير تفاعل الموائع الدقيقة القائم على التدفق المستمر و PCR ذو التبديل الفضائي أمرًا بالغ الأهمية لمعالجة هذه المشكلة.باستخدام قناة سربنتين طويلة أو قناة مستقيمة قصيرة ، يمكن أن يوفر التدفق المستمر PCR تضخيمًا سريعًا عن طريق تدوير الكواشف بنشاط في ثلاث مناطق تسخين مسبق بمضخة خارج الرقاقة.نجحت هذه العملية في تجنب مرحلة الانتقال بين درجات حرارة التفاعل المختلفة وبالتالي تقلل بشكل كبير من وقت الاختبار [62] (الشكل 3 ب).في دراسة أخرى بواسطة Jung et al.[63] اقترح محللًا وراثيًا جديدًا لـ PCR يجمع بين خصائص PCR الثابتة والمتدفقة للنسخ العكسي فائق السرعة ومتعدد الإرسال PCR (الشكل 3 ج).لتضخيم الحمض النووي ، سيتم تدوير رقاقة PCR الدقيقة من خلال ثلاث كتل تسخين عند درجات حرارة مختلفة: 1. كتلة التمسخ 94 درجة مئوية ، 2. كتلة التلدين عند 58 درجة مئوية ، 3. كتلة التمدد عند 72 درجة مئوية.
تطبيق PCR في ميكروفلويديك.تمثيل تخطيطي لـ dirRT-qPCR على منصة ميكروفلويديك (مقتبس من [60]).(ب) تمثيل تخطيطي لمصفوفة ميكروأري PCR ذات التدفق المستمر على أساس قناة اعوج (مقتبس من [62]).ج تمثيل تخطيطي لمحلل وراثي PCR دوار ، يتكون من رقاقة دقيقة وثلاث كتل تسخين ومحرك متدرج (مقتبس من [63]).د رسم تخطيطي للحرارة PCR مع الطرد المركزي والإعداد (مقتبس من [64]).DirRT-qPCR ، تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي المباشر
باستخدام الشعيرات الدموية والحلقات أو حتى الألواح الرفيعة ، يمكن أن يؤدي الحمل الحراري PCR إلى تضخيم الأحماض النووية بسرعة عن طريق الحمل الحراري الحر الطبيعي دون الحاجة إلى مضخة خارجية.على سبيل المثال ، تم تطوير منصة ميكروفلويديك من بوليمر أوليفين دوري على مرحلة تسخين دوارة ملفقة تستخدم التدوير الحراري مع الطرد المركزي في قناة دقيقة PCR حلقة [64] (الشكل ثلاثي الأبعاد).يتم تشغيل محلول التفاعل عن طريق الحمل الحراري ، والذي يقوم باستمرار بتبادل درجات الحرارة العالية والمنخفضة في قناة متناهية الصغر ذات هيكل حلقي.يمكن إكمال عملية التضخيم بأكملها في 10 دقائق بحد كشف يبلغ 70.5 بيكوغرام / قناة.
كما هو متوقع ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع أداة قوية للتشخيص الجزيئي والاستجابة للعينة المتكاملة وأنظمة التحليل متعدد الإرسال.يقلل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع بشكل كبير من الوقت المطلوب للكشف عن SARS-CoV-2 ، مما يساهم في السيطرة الفعالة على جائحة COVID-19.
يتطلب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) جهاز تدوير حراري معقد غير مناسب للاختبار في نقطة الرعاية.في الآونة الأخيرة ، تم تطبيق تقنيات تضخيم متساوي الحرارة على موائع جزيئية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر LAMP ، وتضخيم بوليميريز ريكومبيناز (RPA) ، والتضخيم على أساس تسلسل الحمض النووي [65،66،67،68].باستخدام هذه التقنيات ، يتم تضخيم الأحماض النووية عند درجة حرارة ثابتة ، مما يسهل إنشاء أجهزة نقطة وصول في نقطة الرعاية منخفضة التكلفة وعالية الحساسية للتشخيص الجزيئي.
تسمح فحوصات LAMP عالية الإنتاجية القائمة على الموائع الدقيقة بالكشف المتعدد عن الأمراض المعدية [42 ، 69 ، 70 ، 71].بالاشتراك مع نظام موائع جزيئية بالطرد المركزي ، يمكن لـ LAMP تسهيل أتمتة اكتشاف الحمض النووي [69 ، 72 ، 73 ، 74 ، 75].تم تطوير SlipChip ذات الدوران والتفاعل للكشف البصري للبكتيريا المتوازية المتعددة باستخدام LAMP [76] (الشكل 4 أ).عند استخدام LAMP المحسن في الفحص ، كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء الفلورية حوالي 5 أضعاف ، ووصل حد الكشف إلى 7.2 نسخة / ميكرولتر من الحمض النووي الجيني. علاوة على ذلك ، تم تصور وجود خمسة مسببات أمراض الجهاز الهضمي الشائعة ، بما في ذلك Bacillus cereus و Escherichia coli و Salmonella enterica و Vibrio fluvialis و Vibrio parahaemolyticus ، بناءً على الطريقة في أقل من 60 دقيقة. علاوة على ذلك ، تم تصور وجود خمسة مسببات أمراض الجهاز الهضمي الشائعة ، بما في ذلك Bacillus cereus و Escherichia coli و Salmonella enterica و Vibrio fluvialis و Vibrio parahaemolyticus ، بناءً على الطريقة في أقل من 60 دقيقة.علاوة على ذلك ، تم تصور وجود خمسة مسببات الأمراض البكتيرية الشائعة في الجهاز الهضمي ، بما في ذلك العصوية المخية ، والإشريكية القولونية ، والسالمونيلا المعوية ، و Vibrio fluvialis و Vibrio parahaemolyticus ، باستخدام هذه الطريقة في أقل من 60 دقيقة.此外 ， 基于 该 方法 在 <60 内 可视 化 了 五种 常见 消化道 细菌 病原体 的 ， 包括 包括 、 大肠杆菌 、 肠 沙门氏菌 弧菌 和 副 溶血 性 弧菌。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视 化 了 五 种 常见 消化道 细菌 病 存在 ， 包括 芽孢 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 、 弧菌 和 副 溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 الوركبالإضافة إلى ذلك ، تم تصور وجود خمسة مسببات أمراض معدية معوية شائعة ، بما في ذلك Bacillus cereus و Escherichia coli و Salmonella enterica و Vibrio fluvius و Vibrio parahaemolyticus ، في أقل من 60 دقيقة.
تشمل مزايا LAMP في الموائع الدقيقة ، من بين أمور أخرى ، الاستجابة السريعة والكشف المصغر.ومع ذلك ، وبسبب درجة حرارة التفاعل (حوالي 70 درجة مئوية) ، فإن الهباء الجوي يتولد حتمًا أثناء LAMP ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل إيجابي كاذب.يجب أيضًا تحسين خصوصية الفحص وتصميم التمهيدي والتحكم في درجة الحرارة لـ LAMP.بالإضافة إلى ذلك ، فإن تصميمات الشرائح التي تنفذ الكشف عن أهداف متعددة على شريحة واحدة ذات قيمة كبيرة ويجب تطويرها.بالإضافة إلى ذلك ، يعد LAMP مناسبًا للكشف متعدد الأغراض المدمج في شريحة واحدة ، وهو أمر ذو أهمية كبيرة ، ولكن لا يزال هناك مجال كبير للتطوير.
يمكن تقليل المعدل الإيجابي الخاطئ المرتفع لـ LAMP جزئيًا باستخدام RPA ، حيث تؤدي درجة حرارة التفاعل المنخفضة نسبيًا (~ 37 درجة مئوية) إلى مشاكل تبخر قليلة نسبيًا [77].في نظام RPA ، يبدأ اثنان من البادئات المعاكسة تخليق الحمض النووي عن طريق الارتباط بإعادة التركيب ويمكن إكمال التضخيم في غضون 10 دقائق [78،79،80،81].لذلك ، فإن عملية RPA بأكملها أسرع بكثير من PCR أو LAMP.في السنوات الأخيرة ، ثبت أن تقنية الموائع الدقيقة تعمل على تحسين سرعة ودقة RPA [82،83،84].على سبيل المثال ، Liu et al.[85] طور مقايسة تضخيم إعادة تركيب إنزيم بوليميراز التدفق الجانبي المتكامل ميكروفلويديك للكشف السريع والحساس عن SARS-CoV-2 من خلال دمج النسخ العكسي RPA (RT-RPA) ونظام الكشف عن شريط اختبار التدفق الجانبي الشامل.في نظام موائع جزيئية واحد.الشكل 4 ب).حد الكشف هو نسخة واحدة / ميكرولتر أو 30 نسخة / عينة ، ويمكن إكمال الكشف في حوالي 30 دقيقة.كونغ وآخرون.طوروا جهاز موائع جزيئية يمكن ارتداؤه.[86] تستخدم درجة حرارة الجسم ونظام الكشف عن التألق المعتمد على الهاتف المحمول للكشف السريع والمباشر عن DNA HIV-1 باستخدام RPA (الشكل 4 ج).يكتشف اختبار RPA القابل للارتداء 100 نسخة / مل من التسلسل المستهدف خلال 24 دقيقة ، مما يدل على إمكانات كبيرة للتشخيص السريع للرضع المصابين بفيروس HIV-1 في الأماكن محدودة الموارد.
التضخيم متساوي الحرارة في اختبار نقطة الرعاية (POCT).تطوير وإنتاج SlipChip الانزلاقية والتفاعلية.بعد اللحام بالبلازما ، تم تجميع الرقائق العلوية والسفلية بمجموعة من الصواميل لتشكيل الشريحة النهائية (مقتبسة من [76]).(ب) رسم تخطيطي لنظام MI-IF-RPA لاكتشاف COVID-19 (مقتبس من [85]).(ج) رسم تخطيطي لاختبار RPA يمكن ارتداؤه للكشف السريع عن DNA HIV-1 (مقتبس من [86]).SE Salmonella enterica ، VF Vibrio fluvius ، VP Vibrio parahaemolyticus ، BC Bacillus cereus ، EC Escherichia coli ، FAM carboxyfluorescein ، فيروس نقص المناعة البشرية HIV ، RPA recombinase التضخيم ، الصمام الثنائي الباعث للضوء ، MI-IF-RPA Microfluidase التضخيم
يتطور RPA المستند إلى موائع جزيئية سريعًا ، ومع ذلك ، فإن تكلفة تصنيع الرقائق واستهلاك التفاعل مرتفعة للغاية ويجب تقليلها لزيادة توفر هذه التقنية.بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر الحساسية العالية لـ RPA على تضخيم المنتجات غير المحددة ، خاصة في حالة وجود تلوث.قد تؤثر هذه القيود على تطبيق تقنية RPA في أنظمة ميكروفلويديك وتستحق مزيدًا من التحسين.هناك حاجة أيضًا إلى بادئات وتحقيقات جيدة التصميم لأهداف مختلفة لتحسين جدوى استراتيجيات الموائع الدقيقة القائمة على تقنية RPA في نقطة الرعاية.
Cas13 و Cas12a لديهما القدرة على فصل الأحماض النووية بشكل عشوائي وبالتالي يمكن تطويرهما كأدوات كشف وتشخيص.يتم تنشيط Cas13 و Cas12a عند الارتباط بالحمض النووي المستهدف أو الحمض النووي الريبي ، على التوالي.بمجرد تنشيطه ، يبدأ البروتين في شق الأحماض النووية القريبة الأخرى ، وبعد ذلك يمكن أن يشق توجيه الحمض النووي الريبي (RNAs) الذي يستهدف الأحماض النووية الخاصة بالعوامل الممرضة مجسات الفلورسنت المروية وإطلاق الفلورة.بناءً على هذه النظرية ، Kellner et al.[87] طور أسلوبًا قائمًا على Cas13 [إلغاء قفل المحرر الأنزيمي المحدد عالي الحساسية (شيرلوك)] ، وبروتون وآخرون.[88] طور أسلوبًا آخر يعتمد على Cas12a [CRISPR Trans Reporter الذي يستهدف نوكلياز الحمض النووي (DTECR)].
في السنوات الأخيرة ، ظهرت طرق مختلفة للكشف عن الأحماض النووية على أساس كريسبر [89 ، 90].غالبًا ما تستغرق الطرق التقليدية القائمة على CRISPR وقتًا طويلاً وتستهلك الكثير من العمالة بسبب الإجراءات المتعددة بما في ذلك استخراج الحمض النووي والتضخيم واكتشاف CRISPR.قد يؤدي تعرض السوائل للهواء إلى زيادة فرصة النتائج الإيجابية الكاذبة.بالنظر إلى ما سبق ، فإن الأنظمة القائمة على CRISPR في حاجة ماسة إلى التحسين.
تم تطوير منصة ميكروفلويديك التي يتم التحكم فيها بالهواء المضغوط والتي يمكنها إجراء 24 تحليلًا بشكل متوازٍ لتطبيقات الكشف CRISPR-Cas12a و CRISPR-Cas13a [91].تم تجهيز النظام بجهاز الكشف عن التألق الذي يتجاوز تضخيم الحمض النووي ويكشف تلقائيًا عينات الحمض النووي الريبي والفيمتومولار.Chen et al.[92] تضخيم recombinase متكامل مع نظام CRISPR-Cas12a في موائع مجهرية الطرد المركزي (الشكل 5 أ).يتغلب هذا العمل على صعوبة دمج هاتين العمليتين لأن Cas12a يمكن أن يهضم الحمض النووي للرسول ويمنع عملية التضخيم.بالإضافة إلى ذلك ، Chen et al.[92] بالإضافة إلى ذلك ، قم بتخزين كواشف التفاعل مسبقًا في جهاز تحكم في موائع جزيئية بالطرد المركزي لإكمال العملية بالكامل تلقائيًا.في عمل آخر ، سيلفا وآخرون.[93] طور طريقة تشخيص بدون تضخيم CRISPR / Cas12a وهاتف ذكي لاكتشاف SARS-CoV-2 (الشكل 5 ب).يشتمل هذا الاختبار ، المعروف باسم نظام خالٍ من التضخيم المستند إلى الهاتف الخلوي ، على إنزيم يعتمد على CRISPR / Cas والذي يعتمد على تصور الهاتف الذكي لإشارات الفقاعات الناتجة عن الكاتلاز في قنوات ميكروفلويديك.الكشف الحساس عن أقل من 50 نسخة / ميكرولتر من الحمض النووي بدون تضخيم مسبق ، تستغرق العملية برمتها من حقن العينة إلى قراءة الإشارة 71 دقيقة فقط.
طرق الكشف عن الحمض النووي على أساس كريسبر.الطرد المركزي في نقطة الرعاية للتشخيص الجزيئي المتكامل القائم على كريسبر (مقتبس من [92]).(ب) تطوير اختبار CASCADE للتحليل المستند إلى الهاتف الذكي لـ SARS-CoV-2 (مقتبس من [93]).تضخيم RAA recombinase ، عزر protospacer المجاور PAM ، CRISPR متكرر متناوب قصير متجمع على فترات منتظمة ، نظام CASCADE بدون تضخيم الهاتف الخلوي مع الإنزيمات المعتمدة على CRISPR / CAS ، 1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride EDC
كخطوة أخيرة في اكتشاف الحمض النووي ، يعكس الكشف عن الإشارات نتائج التشخيص بشكل مباشر وهو عامل حاسم في تطوير وسيلة اختبار في نقطة الرعاية تتسم بالكفاءة والحساسية والدقة.يمكن قراءة الإشارات باستخدام طرق مختلفة مثل الإستراتيجيات الفلورية والكهروكيميائية واللونية والمغناطيسية.في هذا القسم ، نصف الأساس المنطقي لكل نهج ونقارن التشخيص الجزيئي للأمراض المعدية في الموائع الدقيقة.
تُستخدم الاستراتيجيات القائمة على الإسفار على نطاق واسع لتشخيص الأمراض المعدية في نقطة الرعاية في نقطة الرعاية نظرًا لمزاياها الرائعة المتمثلة في الحساسية الممتازة والتكلفة المنخفضة وسهولة التشغيل وتحليل نقطة الرعاية [94 ، 95].تستخدم هذه الاستراتيجيات الفلوروفورات المسمى مثل الأصباغ الفلورية والمواد النانوية لإنشاء إشارة قابلة للاكتشاف (تعزيز الفلورة أو التبريد).تشير هذه النتيجة إلى أنه يمكن تقسيم الاستراتيجيات المستندة إلى الفلورية إلى وضع العلامات الفلورية المباشرة ، والإشارة على ، وكشف الفلورسنت عن الإشارة [96].يستخدم الكشف المباشر عن ملصق الفلورسنت ملصقات الفلورسنت الخاصة لتسمية الروابط المحددة التي تولد كمية محددة من التألق عند ربطها بشكل انتقائي بالهدف.للكشف عن التألق القائم على الإشارة ، ترتبط جودة إشارة الفلورسنت بشكل إيجابي بحجم الاهتمام.كثافة الإسفار لا تكاد تذكر في حالة عدم وجود هدف ويمكن اكتشافها عند وجود كمية كافية من الهدف.على العكس من ذلك ، فإن شدة التألق المكتشفة بواسطة "إشارة إيقاف" الفلورة تتناسب عكسياً مع مقدار الهدف ، حيث تصل في البداية إلى قيمة قصوى وتتناقص تدريجياً كلما تم تكبير الهدف.على سبيل المثال ، باستخدام آلية الانقسام عبر الانقسام المعتمدة على الهدف CRISPR-Cas13a ، Tian et al.[97] طور استراتيجية التعرف الجديدة لاكتشاف الحمض النووي الريبي الذي يتجاوز النسخ العكسي مباشرة (الشكل 6 أ).عند الارتباط بالـ RNAs المستهدفة التكميلية ، يمكن تنشيط مجمع CRISPR-Cas13-RNA ، مما يؤدي إلى الانقسام الجانبي بواسطة RNAs المراسل غير المحدد.يتم إخماد المراسل المسمى الفلوريسنتلي [فلوروفور (F)] عن طريق إخماد (Q) سليم والفلور عندما يشق بواسطة المجمع المنشط.
ميزة الكشف الكهروكيميائي هي سرعة الكشف العالية ، الإنتاج السهل ، التكلفة المنخفضة ، سهولة الحمل والتحكم الآلي.إنها طريقة تحليلية قوية لتطبيقات الاختبارات في نقطة الرعاية.استنادًا إلى ترانزستورات التأثير الميداني للجرافين Gao et al.[98] طور جهاز استشعار نانوي للكشف المتعدد عن مستضدات مرض لايم من بكتيريا بوريليا بورجدورفيري بحد اكتشاف 2 بيكوغرام / مل (الشكل 6 ب).
تم استخدام المقايسات اللونية في تطبيقات الاختبارات في نقطة الرعاية ، مستفيدة من مزايا قابلية النقل ، والتكلفة المنخفضة ، وسهولة التحضير ، والقراءة المرئية.يمكن أن يستخدم الكشف اللوني أكسدة البيروكسيديز أو المواد النانوية الشبيهة بالبيروكسيديز ، وتجميع المواد النانوية ، وإضافة صبغات المؤشر لتحويل المعلومات حول وجود الأحماض النووية المستهدفة إلى تغيرات في اللون المرئي [99 ، 100 ، 101].وتجدر الإشارة إلى أن جزيئات الذهب النانوية تُستخدم على نطاق واسع في تطوير استراتيجيات القياس اللوني ، وبسبب قدرتها على إحداث تغييرات سريعة وهامة في اللون ، هناك اهتمام متزايد بتطوير منصات قياس الألوان في نقطة الرعاية للتشخيص الموضعي للأمراض المعدية [102].باستخدام جهاز موائع دقيق للطرد المركزي متكامل [103] ، يمكن اكتشاف مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء في عينات الحليب الملوث تلقائيًا على مستوى 10 خلايا بكتيرية ، ويمكن قراءة النتائج بصريًا في غضون 65 دقيقة (الشكل 6 ج).
يمكن لتقنيات الاستشعار المغناطيسي أن تكتشف التحليلات بدقة باستخدام المواد المغناطيسية ، وكان هناك اهتمام كبير بتطبيقات الاختبارات في نقطة الرعاية في العقود الأخيرة.تتمتع تقنيات الاستشعار المغناطيسي ببعض المزايا الفريدة مثل المواد المغناطيسية منخفضة التكلفة بدلاً من المكونات البصرية باهظة الثمن.ومع ذلك ، فإن استخدام المجال المغناطيسي يحسن كفاءة الكشف ويقلل من وقت تحضير العينة [104].بالإضافة إلى ذلك ، تُظهر نتائج الفحص المغناطيسي خصوصية عالية ، وحساسية ، ونسبة إشارة إلى ضوضاء عالية بسبب إشارة الخلفية المغناطيسية غير المهمة للعينات البيولوجية [105].شارما وآخرون.دمج جهاز استشعار حيوي قائم على تقاطع نفق مغناطيسي في منصة رقاقة صغيرة محمولة.[106] للكشف المتعدد عن مسببات الأمراض (الشكل 6 د).تكتشف المستشعرات الحيوية بحساسية الأحماض النووية دون النانوية المعزولة من مسببات الأمراض.
طريقة الكشف عن الإشارة النموذجية.مفهوم الكشف المفرط الموضعي لـ Cas13a (مقتبس من [97]).(ب) مستشعر الجرافين النانوي FET بالاشتراك مع Lyme GroES scFv (مقتبس من [98]).ج مؤشرات قياس الألوان للكشف المتعدد عن مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء في شريحة ميكروفلويديك للطرد المركزي: العينات رقم 1 ورقم 3 مع مسببات الأمراض المستهدفة ، والعينات رقم 2 ورقم 4 ورقم 5 بدون مسببات الأمراض المستهدفة (مقتبس من [103]) .د مستشعر حيوي يعتمد على تقاطع نفق مغناطيسي ، بما في ذلك منصة ، ومكبر صوت مدمج ، ووحدة تحكم ، ومصدر طاقة لتوليد / اكتساب الإشارات (مقتبس من [106]).GFET Graphene FET ، Escherichia coli ، Escherichia coli ، Salmonella typhimurium ، Vibrio parahaemolyticus ، Vibrio parahaemolyticus ، Listeria monocytogenes ، PC PC ، PDMS ثنائي الميثيكون ، PMMA بولي ميثيل ميثاكريلات
على الرغم من الخصائص الممتازة لطرق الكشف المذكورة أعلاه ، إلا أنها لا تزال تحتوي على عيوب.تتم مقارنة هذه الأساليب (الجدول 1) ، بما في ذلك بعض التطبيقات مع التفاصيل (الإيجابيات والسلبيات).
مع تطور الموائع الدقيقة والأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة وتكنولوجيا النانو وعلوم المواد ، يتقدم استخدام رقائق الموائع الدقيقة للكشف عن الأمراض المعدية باستمرار [55،96،107،108].يساهم التلاعب الدقيق بالمعدات والسوائل المصغرة في دقة التشخيص وفعالية التكلفة.لذلك ، لمزيد من التطوير ، تم بذل جهود لتحسين الرقائق وترقيتها ، مما أدى إلى إنتاج رقائق موائع جزيئية مختلفة بهياكل ووظائف مختلفة.نقدم هنا بإيجاز عدة أنواع شائعة من منصات ميكروفلويديك ومقارنة خصائصها (الإيجابيات والسلبيات).بالإضافة إلى ذلك ، تركز معظم الأمثلة المدرجة أدناه بشكل أساسي على مكافحة SARS-CoV-2.
LOCCs هي أكثر الأنظمة التحليلية المعقدة المصغرة شيوعًا وعملياتها شديدة الصغر ومتكاملة وآلية ومتوازنة من حقن العينة وإعدادها والتحكم في التدفق وكشف السوائل [109 ، 110].يتم التلاعب بالسوائل من خلال هندسة مصممة بعناية وتفاعل العديد من التأثيرات الفيزيائية مثل تدرجات الضغط والعمل الشعري والديناميكا الكهربية والمجالات المغناطيسية والموجات الصوتية [111].يُظهر LOCC مزايا ممتازة في الفحص عالي الإنتاجية والكشف المتعدد ، مع سرعة تحليل سريعة ، وحجم عينة صغير ، واستهلاك منخفض للطاقة ، وكفاءة عالية في الإدارة والتشغيل ؛ومع ذلك ، فإن أجهزة LOCC حساسة للغاية ، وتصنيعها وتعبئتها وتوصيلها.ومع ذلك ، فإن مضاعفة الإرسال وإعادة الاستخدام يواجهان صعوبات هائلة [96].بالمقارنة مع المنصات الأخرى ، تتمتع LOCC بمزايا فريدة من حيث أقصى تنوع للتطبيق وأفضل توافق مع التكنولوجيا ، ولكن عيوبها واضحة أيضًا ، وهي التعقيد العالي وضعف التكرار.الاعتماد على المضخات الخارجية ، والتي غالبًا ما تكون ضخمة ومكلفة ، يحد من استخدامها في نقطة الرعاية.
أثناء اندلاع COVID-19 ، تلقى LOCC الكثير من الاهتمام.في الوقت نفسه ، هناك العديد من الرقائق الجديدة التي تجمع بين العديد من التقنيات.على سبيل المثال ، تُستخدم الهواتف الذكية الآن على نطاق واسع كأجهزة تحليل محمولة ولديها إمكانات كبيرة لتكامل LOCC.صن وآخرون.[21] صنعت شريحة ميكروفلويديك تسمح بمضاعفة تسلسل الحمض النووي المحدد لخمسة مسببات الأمراض ، بما في ذلك SARS-CoV-2 ، باستخدام LAMP وتحليلها باستخدام هاتف ذكي في غضون ساعة واحدة بعد نهاية التفاعل.كمثال آخر ، Sundah et al.[112] أنشأ مفتاحًا جزيئيًا [تضخيم محفز بواسطة مفتاح حالة الانتقال الجزيئي (CATCH)] للكشف المباشر والحساس عن أهداف SARS-CoV-2 RNA باستخدام الهواتف الذكية. يتوافق CATCH مع LOCC المحمول ويحقق أداءً فائقًا (حوالي 8 نسخ RNA / ميكرولتر ؛ أقل من ساعة في درجة حرارة الغرفة) [112]. يتوافق CATCH مع LOCC المحمول ويحقق أداءً فائقًا (حوالي 8 نسخ RNA / ميكرولتر ؛ أقل من ساعة في درجة حرارة الغرفة) [112]. كاتش совместим портативным LOCC и обеспечивает превосходную производителммсть (примерно 8 копий. يتوافق CATCH مع LOCC المحمول ويوفر إنتاجية ممتازة (حوالي 8 نسخ من الحمض النووي الريبي / ميكرولتر ؛ أقل من ساعة في درجة حرارة الغرفة) [112]. كاتش 与 便携式 LOCC 兼容 并 具有 卓越 的 性能 （大约 8 RNA 拷贝 / ميكرولتر ； 室温 下 <1 小时） [112]。 كاتش 与 便携式 LOCC 兼容 并 具有 卓越 的 性能 （大约 8 RNA 拷贝 / ميكرولتر ； 室温 下 <1 小时） [112]。 كاتش совместим сортативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примернио 8 копий؛ يتوافق CATCH مع LOCCs المحمولة ولديه أداء ممتاز (حوالي 8 نسخ من الحمض النووي الريبي / ميكرولتر ؛ أقل من ساعة في درجة حرارة الغرفة) [112].بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم أجهزة LOCC للتشخيص الجزيئي أيضًا بعض القوى الدافعة مثل الفراغ والتمدد والمجالات الكهربائية.كانغ وآخرون.[113] أظهر تفاعل البوليميراز السلسلي النانوي بسرعة فائقة في الوقت الحقيقي للتشخيص السريع والكمي لـ COVID-19 في المجال باستخدام شريحة PCR سائلة plasmonic مفرغة.لي وآخرون.[114] طور لاحقًا شريحة ميكروفلويديك مدفوعة بالامتداد والتي مكنت من تشخيص COVID-19.تستخدم المنصة نظام التضخيم RT-LAMP لتحديد ما إذا كانت العينة إيجابية أو سلبية نوعياً.بعد ذلك ، راماشاندران وآخرون.[115] حقق تدرجات المجال الكهربائي المناسبة باستخدام الرحلان المتساوي (ITP) ، وهي تقنية تركيز أيون انتقائي مطبقة في الموائع الدقيقة.باستخدام ITP ، يمكن تنقية الحمض النووي الريبي المستهدف من عينات مسحة البلعوم الأنفي الخام تلقائيًا.ثم راماشاندران وآخرون.[115] بدمج تنقية ITP مع LAMP المعزز بـ ITP ومقايسات CRISPR اكتشف SARS-CoV-2 في مسحة البلعوم البشرية والعينات السريرية في حوالي 35 دقيقة.بالإضافة إلى ذلك ، تظهر أفكار جديدة باستمرار.Jadhav et al.[116] اقترح مخططًا تشخيصيًا يعتمد على مطيافية رامان المعززة بالسطح جنبًا إلى جنب مع جهاز ميكروفلويديك يحتوي إما على أنابيب نانوية كربونية مطلية بالذهب / الفضة عموديًا أو أنابيب ميكروية / نانوية يمكن التخلص منها بالكهرباء.يمكن التخلص من القنوات الدقيقة للفلتر المدمجة التي تعمل بالغشاء.يمتص الجهاز الفيروسات من سوائل / إفرازات الجسم المختلفة مثل اللعاب والبلعوم الأنفي والدموع.وبالتالي ، فإن عيار الفيروس وفير ويمكن التعرف على الفيروس بدقة من خلال توقيع رامان.
LOAD عبارة عن منصة طرد مركزي موائع جزيئية يتم فيها التحكم في جميع العمليات بواسطة بروتوكول تردد يقوم بتدوير ركيزة ذات بنية دقيقة [110].يتميز جهاز LOAD باستخدام قوة الطرد المركزي كقوة دافعة مهمة.تخضع السوائل أيضًا لقوى الشعيرات الدموية وقوى أويلر وكوريوليس.باستخدام جهاز طرد مركزي ، يتم إجراء التحليلات في عملية سائلة مستمرة من موضع شعاعي إلى الداخل إلى الخارج ، مما يلغي الحاجة إلى أنابيب خارجية إضافية ومضخات ومشغلات وصمامات نشطة.باختصار ، طريقة تحكم واحدة تبسط العملية.القوى المؤثرة على السائل في نفس قناة ميكروفلويديك على نفس المسافة من مركز الحمل متساوية ، مما يجعل من الممكن تكرار بنية القناة.وبالتالي ، فإن معدات LOAD أبسط وأكثر اقتصادا في التصميم والتصنيع من معدات LOCC التقليدية ، في حين أن التفاعلات مستقلة ومتوازية إلى حد كبير ؛ومع ذلك ، نظرًا للقوة الميكانيكية العالية لمعدات الطرد المركزي ، فإن مادة الرقائق المتاحة محدودة والأحجام الصغيرة صعبة.الى السيارة.في الوقت نفسه ، تم تصميم معظم أجهزة LOAD للاستخدام الفردي فقط ، وهو أمر مكلف للكشف على نطاق واسع [96 ، 117 ، 118 ، 119].
في العقود الأخيرة ، حظي LOAD ، الذي يعتبر أحد أكثر أجهزة ميكروفلويديك الواعدة ، باهتمام كبير من الباحثين والمصنعين.وبالتالي ، اكتسب LOAD قبولًا واسعًا واستخدم في التشخيص الجزيئي لمسببات الأمراض المعدية [120 ، 121 ، 122 ، 123 ، 124] ، خاصة أثناء تفشي COVID-19.على سبيل المثال ، في نهاية عام 2020 ، جي وآخرون.[60] أظهر مقايسة RT-qPCR مباشرة للكشف المتوازي السريع والآلي عن عدوى SARS-CoV-2 والإنفلونزا A و B في عينات مسحة الحلق.ثم شيونغ وآخرون.[74] قدم منصة موائع قرصية مدمجة في برنامج LAMP للكشف السريع والدقيق والمتزامن عن سبعة فيروسات فيروسات تنفسية بشرية ، بما في ذلك SARS-CoV-2 ، في غضون 40 دقيقة.في أوائل عام 2021 ، دي أوليفيرا وآخرون.[73] أظهر رقاقة موائع جزيئية للطرد المركزي لحبر البوليسترين ، يتم تشغيلها يدويًا باستخدام محور دوار بأطراف الأصابع ، من أجل التشخيص الجزيئي لـ RT-LAMP لـ COVID-19.بعد ذلك ، Dignan et al.[39] قدم جهازًا صغيرًا محمولًا آليًا للطرد المركزي لتنقية SARS-CoV-2 RNA مباشرة من أقسام المسحة الشدقية.ميدفيد وآخرون.[53] اقترح نظامًا مضمنًا لأخذ عينات الهباء الجوي SARS-CoV-2 مع شريحة فلورية صغيرة الحجم دوارة مع حد اكتشاف يبلغ 10 نسخ / ميكرولتر وعتبة دورة لا تقل عن 15 دقيقة.سواريز وآخرون[75] أبلغت مؤخرًا عن تطوير منصة معيارية متكاملة للموائع الدقيقة للطرد المركزي للكشف المباشر عن SARS-CoV-2 RNA في عينات مسحة البلعوم الأنفي المعطل بالحرارة باستخدام LAMP.توضح هذه الأمثلة الفوائد العظيمة والوعود لـ LOAD في التشخيص الجزيئي لـ COVID-19.
في عام 1945 ، قدم مولر وكليج [125] لأول مرة قنوات ميكروفلويديك على الورق باستخدام ورق الترشيح والبارافين.في عام 2007 ، أنشأت مجموعة Whitesides [126] أول منصة ورقية وظيفية لاختبار البروتين والجلوكوز.أصبح الورق ركيزة مثالية للموائع الدقيقة.يحتوي الورق على خصائص متأصلة مثل الماء والبنية المسامية ، والتوافق الحيوي الممتاز ، والوزن الخفيف ، والمرونة ، وقابلية الطي ، والتكلفة المنخفضة ، وسهولة الاستخدام والراحة.تتكون µPADs الكلاسيكية من هياكل محبة للماء / كارهة للماء مبنية على ركائز ورقية.اعتمادًا على الهيكل ثلاثي الأبعاد ، يمكن تقسيم μPADs إلى μPADs ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D).يتم إنتاج 2D µPADs عن طريق تشكيل حدود مسعورة لتشكيل قنوات ميكروفلويديك ، بينما تصنع لوحات PAD ثلاثية الأبعاد عادةً من أكوام من طبقات من ورق موائع جزيئي ثنائي الأبعاد ، أحيانًا عن طريق طي الورق ، وتقنيات الانزلاق ، والقنوات المفتوحة ، والطباعة ثلاثية الأبعاد [96].يتم التحكم في السوائل المائية أو البيولوجية الموجودة على μPAD بشكل أساسي بواسطة القوة الشعرية بدون مصدر طاقة خارجي ، مما يسهل التخزين المسبق للكواشف ومعالجة العينات واكتشاف تعدد الإرسال.ومع ذلك ، يتم إعاقة التحكم الدقيق في التدفق واكتشاف تعدد الإرسال بسبب عدم كفاية سرعة الكشف والحساسية وقابلية إعادة الاستخدام [96 ، 127 ، 128 ، 129 ، 130].
كمنصة غير عادية للموائع الدقيقة ، تم الترويج لـ μPAD وتطويره على نطاق واسع للتشخيص الجزيئي للأمراض المعدية مثل HCV و HIV و SARS-CoV-2 [131 ، 132].للكشف الانتقائي والحساس عن HCV ، Tengam et al.[133] طور جهاز استشعار حيوي جديد يعتمد على ورق الفلورسنت باستخدام مسبار حمض نووي عالي التحديد يعتمد على البيروليدينيل الببتيد.يتم تجميد الأحماض النووية تساهميًا على ورق السليلوز المؤكسد جزئيًا عن طريق الألكلة الاختزالية بين المجموعات الأمينية ومجموعات الألدهيد ، ويعتمد الكشف على التألق.يمكن قراءة هذه الإشارات بواسطة أداة مصنوعة خصيصًا بكاميرا فلورية محمولة مع كاميرا هاتف محمول.في وقت لاحق ، لو وآخرون.[134] صمم قطبًا مرنًا من الورق يعتمد على جزيئات النيكل / الذهب النانوية / الأنابيب النانوية الكربونية / مركبات الإطار المعدني العضوي من كحول البولي فينيل للكشف عن هدف فيروس نقص المناعة البشرية عن طريق تهجين الحمض النووي باستخدام الميثيلين الأزرق كمؤشر لأكسدة الحمض النووي.في الآونة الأخيرة ، Chowdury et al.[135] قدم تصميمًا افتراضيًا لمنصة اختبار نقطة الرعاية µPAD باستخدام لعاب المريض الخام بالاشتراك مع LAMP وتكنولوجيا التصوير المحمولة للكشف عن تحليل COVID-19.
توجه اختبارات التدفق الجانبي السوائل بواسطة القوى الشعرية وتتحكم في حركة السوائل من خلال قابلية البلل وخصائص الركائز المسامية أو البنية المجهرية.تتكون أجهزة التدفق الجانبي من عينات ، مترافقة ، حاضنة وكشف ، وسادات ماصة.تتعرف جزيئات الحمض النووي في LFA على روابط معينة يتم تخزينها مسبقًا في موقع الربط وترتبط كمجمعات.عندما يمر السائل عبر لوحات الحضانة والكشف ، يتم التقاط المجمعات بواسطة جزيئات الالتقاط الموجودة على خطوط الاختبار والتحكم ، مما يُظهر النتائج التي يمكن قراءتها مباشرة بالعين المجردة.عادة ، يمكن إكمال LFA في 2-15 دقيقة ، وهو أسرع من الاكتشاف التقليدي.نظرًا للآلية الخاصة ، يتطلب LFA عددًا قليلاً من العمليات ولا يتطلب معدات إضافية ، مما يجعله سهل الاستخدام للغاية.من السهل تصنيعها وتصغيرها ، كما أن تكلفة الركائز الورقية أقل.ومع ذلك ، يتم استخدامه فقط للتحليل النوعي ، والكشف الكمي صعب للغاية ، وقدرة تعدد الإرسال والإنتاجية محدودة للغاية ، ويمكن اكتشاف حمض نووي واحد كافٍ فقط في المرة الواحدة [96،110،127].
على الرغم من أن معظم تطبيقات LFA تركز على المقايسات المناعية ، فإن استخدام LFA للتشخيص الجزيئي في رقائق موائع جزيئية فعال وشائع أيضًا [136].في حالة فيروس التهاب الكبد B ، وفيروس نقص المناعة البشرية و SARS-CoV-2 LFA Gong et al.[137] اقترح منصة LFA للجسيمات النانوية ذات التحويل التصاعدي وأظهر تعدد استخدامات هذه المنصة المصغرة والمحمولة من خلال الكشف الحساس والكمي لأهداف متعددة مثل الحمض النووي HBV.بالإضافة إلى ذلك ، فو وآخرون.[138] أظهر LFA جديدًا يعتمد على مطيافية رامان المعززة على السطح من أجل التحليل الكمي للحمض النووي HIV-1 بتركيزات منخفضة.للكشف السريع والحساس عن SARS-CoV-2 ، Liu et al.[85] طور تحليل التدفق الجانبي المتكامل للموائع الدقيقة RPA من خلال الجمع بين RT-RPA ونظام عالمي للكشف عن التدفق الجانبي في نظام موائع جزيئية واحد.
يختلف تطبيق منصات ميكروفلويديك المختلفة اعتمادًا على دراسات محددة ، مع الاستفادة الكاملة من إمكانيات ومزايا المنصات.بفضل الصمامات والمضخات والقنوات ذات الأسعار المعقولة ، تعد LOCC هي المنصة الأكثر شمولاً لتنوع التطبيقات وقابلية التشغيل البيني مع أكبر مساحة للتطوير.لذلك ، نأمل ونوصي بإجراء أحدث الدراسات في LOCC كمحاولة أولى وأن يتم تحسين الظروف.بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع اكتشاف طرق أكثر كفاءة ودقة واستخدامها في النظام.يتفوق LOAD في التحكم الدقيق في السوائل من أجهزة LOCC الحالية ويظهر مزايا فريدة في محركات الأقراص الفردية بواسطة قوة الطرد المركزي دون الحاجة إلى محركات أقراص خارجية ، بينما يمكن أن تكون الاستجابات المتوازية منفصلة ومتزامنة.وبالتالي ، في المستقبل ، سيصبح LOAD المنصة الرئيسية للموائع الدقيقة مع عمليات يدوية أقل وتقنيات أكثر نضجًا وآلية.تجمع منصة µPAD بين مزايا LOCC والمواد المستندة إلى الورق بتكلفة منخفضة ، وتشخيصات تستخدم مرة واحدة.لذلك ، يجب أن يركز التطوير المستقبلي على التقنيات الملائمة والراسخة.بالإضافة إلى ذلك ، فإن LFA مناسب تمامًا للكشف بالعين المجردة ، ويعد بتقليل استهلاك العينة وتسريع الكشف.يتم عرض مقارنة تفصيلية للمنصة في الجدول 2.
تقسم التحليلات الرقمية العينة إلى العديد من المفاعلات الدقيقة ، يحتوي كل منها على عدد منفصل من الجزيئات المستهدفة [139 ، 140].تقدم المقايسات الرقمية مزايا كبيرة لإجراء القياس الكمي المطلق عن طريق إجراء آلاف التجارب البيوكيميائية المتوازية في وقت واحد وبشكل فردي في حجرات مقياس ميكرون بدلاً من مرحلة مستمرة.بالمقارنة مع الموائع الدقيقة التقليدية ، يمكن أن تقلل تفاعلات المقصورة حجم العينة ، وتزيد من كفاءة التفاعل ، ويمكن دمجها بسهولة مع الطرق التحليلية الأخرى دون الحاجة إلى القنوات ، والمضخات ، والصمامات ، والتصميمات المدمجة [141 ، 142 ، 143 ، 144 ، 145 ، 146 ، 147].تُستخدم الطريقتان التاليتان في المقايسات الرقمية لتحقيق فصل منتظم ودقيق للحلول ، بما في ذلك الكواشف والعينات مثل الخلايا والأحماض النووية والجزيئات أو الجزيئات الأخرى: (1) مستحلبات الإسقاط التي تستغل عدم استقرار السطح البيني السائل ؛(2) يتم تقسيم الصفيف بواسطة القيود الهندسية للجهاز.في الطريقة الأولى ، يمكن إنشاء قطرات تحتوي على كواشف وعينات في قنوات متناهية الصغر بطرق سلبية مثل التيار المشترك ، والتدفق المتقاطع ، وتركيز التدفق ، والاستحلاب المرحلي ، واستحلاب القناة الصغيرة ، والأغشية من خلال قوى القص اللزجة والاستحلاب مع تغيير القناة.التوطين [143 ، 145 ، 146 ، 148 ، 149] أو باستخدام طرق نشطة [150 ، 151] ، والتي تقدم طاقة إضافية من خلال التحكم الكهربائي والمغناطيسي والحراري والميكانيكي.في النهج الأخير ، تتم مشاركة أفضل تجانس لحجم السوائل في غرف الموائع الدقيقة عن طريق الحفاظ على الهياكل المكانية من نفس الحجم ، مثل المصفوفات السطحية والميكروية [152،153،154].والجدير بالذكر أن القطرات عبارة عن أقسام تدفق رئيسية يمكن أيضًا إنشاؤها ومعالجتها على مصفوفات الإلكترود استنادًا إلى الموائع الدقيقة الرقمية (DMF).يعتبر التثبيط الكهربائي للعوازل واحدة من أفضل نظريات DMF المدروسة ، نظرًا لأن التثبيط الكهربائي للعوازل يسمح بمعالجة دقيقة للقطرات الفردية ، والتحكم في شكل الإشارات الكهربائية السائلة وغير المتماثلة التي تمر عبر جوانب مختلفة [141 ، 144].تشمل العمليات الرئيسية للقطرات في DMF الفرز والتقسيم والدمج [151 ، 155 ، 156] ، والتي يمكن تطبيقها في مجالات التحليل المختلفة ، لا سيما في الكشف الجزيئي [157 ، 158 ، 159].
الكشف عن الحمض النووي الرقمي هو تقنية تشخيص جزيئي من الجيل الثالث تتبع PCR التقليدي و PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) ، بالتوازي مع التسلسل عالي الإنتاجية والخزعة السائلة.في العقدين الماضيين ، تطورت الأحماض النووية الرقمية بسرعة في مجال التشخيص الجزيئي لمسببات الأمراض المعدية [160 ، 161 ، 162].يبدأ التقدير الكمي المطلق للكشف عن الحمض النووي الرقمي بتعبئة العينات والكواشف في مقصورات فردية للتأكد من أن كل تسلسل مستهدف له نفس احتمالية دخول كل مقصورة فردية.نظريًا ، قد يتم تعيين تسلسلات هدف متعددة لكل قسم ، أو قد لا يكون هناك نظام تفاعل دقيق مستقل.من خلال آليات الاستشعار المختلفة الموضحة أعلاه ، يمكن تصور الأجزاء ذات التسلسلات المستهدفة الميكروبية التي تولد إشارات أعلى من عتبة معينة بالعين المجردة أو بواسطة آلة ويتم تصنيفها على أنها موجبة ، بينما يتم تصنيف الأجزاء الأخرى التي تولد إشارات أقل من العتبة على أنها موجبة .السلبية ، والتي تجعل الإشارة لكل قسم قيمة منطقية.وبالتالي ، من خلال حساب عدد الأجزاء التي تم إنشاؤها ومعدل النتائج الإيجابية بعد التفاعل ، يمكن مطابقة النسخ الأصلية من عينات الاختبار باستخدام صيغة توزيع بواسون دون الحاجة إلى منحنى قياسي ، وهو أمر مطلوب للتحليلات الكمية الروتينية مثل مثل qPCR.[163] بالمقارنة مع طرق التشخيص الجزيئي التقليدية ، فإن الكشف عن الحمض النووي الرقمي لديه درجة أعلى من الأتمتة ، وسرعة تحليل أعلى وحساسية ، وعدد أقل من الكواشف ، وتلوث أقل ، وتصميم وتصنيع أبسط.لهذه الأسباب ، تمت دراسة استخدام المقايسات الرقمية ، وخاصة الطرق القائمة على الإسقاط ، للتشخيص الجزيئي ، والجمع بين تقنيات التضخيم وقراءة الإشارة ، أثناء التفشي الخطير لـ SARS-CoV-2.على سبيل المثال ، Yin et al.[164] طرق الجمع بين طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الرقمية والسريعة للقطيرات للكشف عن جينات ORF1ab و N و RNase P في SARS-CoV-2 في شريحة ميكروفلويديك.والجدير بالذكر أن النظام كان قادرًا على تحديد إشارة إيجابية في غضون 115 ثانية ، وهو أسرع من تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ، مما يشير إلى فعاليته في اكتشاف نقطة الرعاية (الشكل 7 أ).دونغ وآخرون.[165] ، سو وآخرون.[157] ، تشين وآخرون.[166] وألتيري وآخرون.[167] طبقوا أيضًا تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (ddPCR) للكشف عن SARS-CoV-2 في نظام ميكروفلويديك بنتائج مبهرة.لزيادة تحسين معدل الكشف ، Shen et al.[168] حقق التصوير بالرقائق المستند إلى ddPCR في أقل من 15 ثانية دون استخدام تقنيات خياطة الصور ، مما أدى إلى تسريع عملية تقنية ddPCR من المختبر إلى التطبيق.لا يتم تطبيق طرق التضخيم الحراري فقط مثل PCR ، ولكن يتم أيضًا استخدام طرق التضخيم المتساوي الحرارة لتبسيط ظروف التفاعل والاستجابة السريعة.لو وآخرون.[71] طور SlipChip لتحليل القطرات ، القادر على توليد قطرات بأحجام مختلفة بكثافات عالية في خطوة واحدة وتحديد كمية الأحماض النووية SARS-CoV-2 باستخدام المصباح الرقمي (الشكل 7 ب).باعتبارها تقنية سريعة التطور ، يمكن أن تلعب CRISPR أيضًا دورًا مهمًا في الكشف عن الحمض النووي الرقمي من خلال التصوير اللوني الملائم دون الحاجة إلى بقع حمض نووي إضافية.أكرمان وآخرونطور تفاعل مصفوفة اندماجي للتقييم المتعدد للأحماض النووية.[158] اكتشف 169 فيروسًا مرتبطًا بالبشر ، بما في ذلك SARS-CoV-2 ، في قطرات تحتوي على كواشف الكشف عن الحمض النووي القائم على CRISPR-Cas13 في اختبار ميكروويل (الشكل 7 ج).بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام التضخيم متساوي الحرارة وتقنية كريسبر في نفس النظام للجمع بين فوائد كليهما.بارك وآخرون.[169] تم تطوير اختبار رقمي CRISPR / Cas12a في شريحة موائع جزيئية تجارية للكشف عن SARS-CoV-2 المستخرج والمقتل بالحرارة على أساس RT-RPA بمرحلة واحدة مع اكتشاف إشارة إلى الخلفية أقصر وأعلى نسبة الوقت.، نطاق ديناميكي أوسع وحساسية أفضل (الشكل 7 د).يتم إعطاء بعض الأوصاف لهذه الأمثلة في الجدول 3.
منصة رقمية نموذجية لاكتشاف الحمض النووي.(أ) يتكون تدفق العمل الرقمي السريع PCR من أربع خطوات رئيسية: تحضير العينة ، وتوزيع خليط التفاعل ، وعملية التضخيم ، والتقدير الكمي المستهدف (مقتبس من [164]).(ب) رسم تخطيطي يوضح تحليل قطيرات SlipChip لتشكيل القطيرات بكثافة عالية (مقتبس من [71]).ج مخطط سير عمل كارمن كاس 13 (مقتبس من [158]).د نظرة عامة على الاكتشاف الرقمي المتقدم للفيروسات باستخدام كريسبر / كاس في وعاء واحد (مقتبس من [169]).W / O water-in-oil ، polydimethylsiloxane PDMS ، PCR polymerase chain reaction ، جمع بيانات DAQ ، مشتق متكامل نسبي PID ، تفاعل مصفوفة اندماجية CARMEN لتقييم الحمض النووي متعدد الإرسال ، SARS-CoV-2 ، متلازمة الجهاز التنفسي الحادة الوخيمة ، فيروس كورونا 2 ، تضخيم RT للنسخة العكسية recombinase polymerase-RPA ، إشارة S / B في الخلفية